ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 דופּלעקס וועלדעד רער פֿאַר כעמישער ינדאַסטרי כעמישער קאָמפּאָנענט, דיפישאַנסי פון SPECC1L פירט צו געוואקסן פעסטקייַט פון ספּליסט דזשוינץ און רידוסט שעדינג פון קראַניאַל נעוראַל קאַם סעלז.

דאנק איר פֿאַר באזוכן Nature.com.איר נוצן אַ בלעטערער ווערסיע מיט לימיטעד CSS שטיצן.פֿאַר דער בעסטער דערפאַרונג, מיר רעקאָמענדירן אַז איר נוצן אַ דערהייַנטיקט בלעטערער (אָדער דיסייבאַל קאַמפּאַטאַבילאַטי מאָדע אין Internet Explorer).אין אַדישאַן, צו ענשור אָנגאָינג שטיצן, מיר ווייַזן דעם פּלאַץ אָן סטיילז און דזשאַוואַסקריפּט.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 דופּלעקס וועלדעד רער פֿאַר כעמישער ינדאַסטרי

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.איז אַ לידינג פאַבריקאַנט וואס איז ספּעשאַלייזד אין ומבאַפלעקט שטאָל סימלאַס פּייפּס, העל אַננעאַלעד טובז, סימלאַס קוילד טובינג עטק.אין סדר צו פאַסילאַטייט קאַסטאַמערז, מיר האָבן וועלדעד פּייפּס און טובז אויך.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.האט די מערסט אַוואַנסירטע פּראַדוסינג און טעסטינג ויסריכט.מיר קענען טאָוטאַלי באַפרידיקן דיין פאָדערונג.לויט די סטאַנדאַרט זייער שטרענג, טובז וואָס זענען געשאפן דורך אונדז שטענדיק האָבן ריכטיק אָד און ווט טאָלעראַנץ.די טאָלעראַנץ קאָנטראָל איז שטרענג לויט צו פּראָדוצירן סטאַנדאַרדס.אונדזער פּראָדוקטן זענען שטענדיק צופֿרידן מיט קאַסטאַמערז.קאַסטאַמערז פּערטשאַסט אונדזער פּראָדוקטן באשאפן מער פּראַפיץ.
אַ) אָד (ויסווייניקסט דיאַמעטער): 3.18 מם צו 101.6 מם
ב) ווט (וואנט גרעב): 0.5 מם צו 20 מם
c) לענג: לויט צו קונה ס פאָדערונג
ד) סטאַנדאַרדס: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 עטק
e) פּראָצעס מעטאַד: ERW, EFW עטק

סלידערס וואָס ווייַזן דריי אַרטיקלען פּער רוק.ניצן די צוריק און ווייַטער קנעפּלעך צו מאַך דורך די סליידז, אָדער די רוק קאָנטראָללער קנעפּלעך אין די סוף צו מאַך דורך יעדער רוק.
די קראַניאַל נעוראַל קרעסט סעלז (CNCC) סלאָו אַוועק די עמבריאָניק נעוראַל פאָולדז און מייגרייט צו די פאַרינגעאַל אַרטשעס, וואָס פאָרעם רובֿ פון די מידפאַסע סטראַקטשערז.CNCC דיספאַנגקשאַן פיעסעס אַ וויכטיק ראָלע אין די עטיאָלאָגי פון אָראָפאַסיאַל שפּאַלטן, אַ פּראָסט קאַנדזשענאַטאַל מאַלפאָרמיישאַן.העטעראָזיגאָוס SPECC1L מיוטיישאַנז זענען געפֿונען אין פּאַטיענץ מיט ייטיפּיקאַל און סינדראָום קלעפץ.דאָ, מיר באַריכט ענכאַנסט סטיינינג פון קאַנאָניקאַל קלעפּיק קנופּ (AJ) קאַמפּאָונאַנץ, β-קאַטענין און E-קאַדהערין אין געבילדעטער SPECC1L נאַקדאַון סעלז, און עלעקטראָן מיקראָגראַפס ווייַזן אַפּיקאַל-בייסאַל דיפיוזשאַן פון AJ.צו פֿאַרשטיין די ראָלע פון ​​SPECC1L אין קראַניאָפאַסיאַל מאָרפאָגענעסיס, מיר באשאפן אַ ספּעקק1ל דיפישאַנט מויז מאָדעל.האָמאָזיגאָוס מיוטאַנץ זענען עמבריאָניק טויטלעך און ויסשטעלונג ימפּערד נעוראַל רער קלאָוזשער און CNCC לאַמינאַטיאָן.אַדזש פּראָטעין סטיינינג איז געוואקסן אין מוטאַנט נעוראַל פאָולדז.דעם AJ כיסאָרן איז קאָנסיסטענט מיט אַ כיסאָרן אין CNCC דעלאַמינאַטיאָן, ריקוויירינג AJ דיסאַלושאַן.אין אַדישאַן, Specc11 מיוטאַנץ האָבן רידוסט PI3K-AKT סיגנאַלינג און געוואקסן אַפּאָפּטאָסיס.אין וויטראָ, מילד ינאַבישאַן פון PI3K-AKT סיגנאַלינג אין ווילד-טיפּ סעלז איז גענוג צו ינדוסירן AJ ענדערונגען.ימפּאָרטאַנטלי, AJ ענדערונגען ינדוסט דורך SPECC1L נאַקדאַון קענען זיין ריווערסט דורך אַקטאַוויישאַן פון די PI3K-AKT פּאַטוויי.צוזאַמען, די דאַטן פֿאָרשלאָגן אַז SPECC1L, ווי אַ ראָמאַן רעגולאַטאָר פון PI3K-AKT סיגנאַלינג און AJ ביאָלאָגי, איז פארלאנגט פֿאַר נעוראַל רער קלאָוזשער און CNCC סטראַטיפיקאַטיאָן.
קראַניאַל נעוראַל קרעסט סעלז (CNCCs) לאָוקאַלייזד צו די דאָרסאַל נעוראָעקטאָדערם און אָפּטיילן פון די נעוראָעפּיטהעליום פון די דעוועלאָפּינג נעוראַל פאָולדז דורך אַ פּראָצעס מיט די עפּיטעליאַל-מעסענטשימאַל יבערגאַנג (EMT) 1,2,3.פּרעמיגראַטינג עפּיטעליאַל קנקקס דיסראַפּץ ינטערסעללולאַר דזשונקטיאָנס און ווערן מייגרייטינג מעסענטשימאַל קנקקס וואָס פּלאָמבירן די ערשטער און רגע פאַרינגעאַל אַרטשעס און פאָרעם רובֿ פון די קראַניאָפאַסיאַל קאַרטאַלאַדזש.אזוי, גענעס וואָס רעגולירן CNCC פונקציע זענען אָפט דיסראַפּטיד אין די עטיאָלאָגי פון קראַניאָפאַסיאַל קאַנדזשענאַטאַל אַנאַמאַליז אַזאַ ווי אָראָפאַסיאַל קלעפץ, רובֿ קאַמאַנלי אַפעקטינג 1/800 געבורט אין די יו.איינער פון די קאַנדזשענאַטאַל דיפאָרמאַטיז 8.
דעלאַמינאַטיאָן פון די CNCC קאָוינסיידז מיט די קלאָוזשער פון די אַנטיריער נעוראַל רער צווישן 8.5 און 9.5 טעג פון עמבריאָניק אַנטוויקלונג אין מיסע.מיוטאַנץ פון אַ נומער פון מויז אָראָפאַסיאַל קלעפט-פארבונדן גענעס אויך ויסשטעלונג עטלעכע פאָרעם פון נעוראַל רער כיסאָרן, אַרייַנגערעכנט Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 און Pdgfrα12.אָבער, די פּראַסעסאַז פון נעוראַל רער קלאָוזשער און CNCC סטראַטיפיקאַטיאָן קענען זיין גערעכנט ווי פרייַ, ווייַל די ספּלאָטש מוטאַנט מויז (Pax3) יגזיבאַץ חסרונות אין נעוראַל רער קלאָוזשער אָן קיין ווירקונג אויף CNCC סטראַטיפיקאַטיאָן אָדער מיגראַטיאָן 13,14.נאָך מויז מאָדעלס מיט חסרונות אין CNCC דייסעקשאַן און נעוראַל רער קלאָוזשער וועט העלפֿן דילייין די פּראָסט מאָלעקולאַר יקער פון די צוויי פּראַסעסאַז.
אפגעזונדערטקייט פון CNCC פון נעוראָעפּיטהעליאַל סעלז ריקווייערז די דיסאַלושאַן פון קלעפּיק דזשונקטיאָנס (AJs), וואָס זענען פארפאסט פון פּראָטעין קאַמפּלעקסאַז מיט, צווישן אנדערע, E-קאַדהירין, β-קאַטענין, α-E-קאַטענין און α-אַקטינין פֿאַרבונדן מיט אַקטין פילאַמאַנץ 2. אָווערעקספּרעססיאָן שטודיום E-קאַדהערין אין נעוראַל פאָולדז געוויזן אַ רעדוקציע אָדער פאַרהאַלטן אין CNCC דעלאַמינאַטיאָן.קאָנווערסעלי, סאַפּרעשאַן פון E- קאַדהערין רעזולטאטן אין פרי סטראַטיפיקאַטיאָן15,16.פילע פון ​​די סיבות וואָס פאַרמיטלען EMT בעשאַס CNCC סטראַטיפיקאַטיאָן זענען טראַנסקריפּציע סיבות (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) און עקסטראַסעללולאַר מאַטריץ (ECM) רימאַדלינג פּראָטעינס אַזאַ ווי מאַטריץ מעטאַללאָפּראָטעינאַסעס (ממפּס), אָבער CNCCs זענען דירעקט סיטאָסקעלעטאַל אַדזש רעגולאַטאָרס. נאך נישט באקאנט.די PI3K-AKT פּאַטוויי איז באַוווסט צו אַנטאַגאַנייז E- קאַדהירין לעוועלס, דער הויפּט פֿון ראַק פאָרשונג17.לעצטע שטודיום האָבן געוויזן אַז אָנווער פון PDGFα-באזירט PI3K-AKT סיגנאַלינג אין מיסע פירט צו קראַניאָפאַסיאַל אַבנאָרמאַלאַטיז, אַרייַנגערעכנט שפּאַלטן גומע און נעוראַל רער חסרונות12.אָבער, די שייכות צווישן די PI3K-AKT פּאַטוויי און AJ פעסטקייַט אויף CNCC סטראַטיפיקאַטיאָן איז ומקלאָר.
מיר פריער יידענאַפייד SPECC1L ווי דער ערשטער מוטאַנט דזשין אין צוויי מענטשן מיט אַ שטרענג שפּאַלט וואָס יקסטענדז פון די מויל צו די אויג, באקאנט ווי אַבליק קלעפט (ObFC) אָדער Tessier IV18 שפּאַלט.SPECC1L מיוטיישאַנז זענען יידענאַפייד אין צוויי מולטי-גענעראַטיאָנאַל פאַמיליעס מיט די אַוטאָסאָמאַל דאָמינאַנט Opitz G/BBB סינדראָום (OMIM #145410), אין וואָס אַפעקטיד מענטשן האָבן יגזיבאַטאַד כייפּערדיסטאַנסע און שפּאַלטן ליפּ / גומע 19, און אין איין משפּחה מיט טיבי אָוווערדיסטאַנס סינדראָום (OMIM #145420)20 .מער ווי האַלב פון קאַסעס פון Opitz G/BBB סינדראָום זענען X-לינגקט (OMIM #300000) און זענען געפֿירט דורך מיוטיישאַנז אין די MID1 דזשין, וואָס קאָדעקס פּראָטעין 22 פון די מיקראָטובולע-פארבונדן צעל סקעלעט.מיר כייפּאַטייזיז אַז SPECC1L, אויך אַ פּראָטעין פֿאַרבונדן מיט מיקראָטובולעס און די אַקטין סיטאָסקעלעטאָן, קען פאַרמיטלען סיגנאַלינג פארלאנגט פֿאַר אַקטין סיטאָסקעלעטאָן רימאַדאַלינג בעשאַס צעל אַדכיזשאַן און מייגריישאַן 18.דורך אין וויטראָ און אין וויוואָו שטודיום, מיר איצט באַשרייַבן SPECC1L ווי אַ ראָמאַן רעגולאַטאָר פון AJ פעסטקייַט דורך PI3K-AKT סיגנאַלינג.אין די סעליאַלער מדרגה, SPECC1L דיפישאַנסי ריזאַלטיד אין אַ פאַרקלענערן אין די מדרגה פון די פּאַנ-AKT פּראָטעין און אַ פאַרגרעסערן אין די אַפּיקאַל-בייסאַל דיספּערשאַן פון AJ, וואָס איז געווען ילימאַנייטאַד דורך כעמישער אַקטאַוויישאַן פון די AKT פּאַטוויי.אין וויוואָו, Specc11-דיפישאַנט עמבריאָוז ווייַזן ימפּערד נעוראַל רער קלאָוזשער און רידוסט CNCC דייסעקשאַן.אזוי, SPECC1L פאַנגקשאַנז אין העכסט רעגיאַלייטאַד צעל אַדכיזשאַן-באזירט סיגנאַלינג פארלאנגט פֿאַר נאָרמאַל CNCC פונקציע בעשאַס פאַסיאַל מאָרפאָגענעסיס.
צו קעראַקטערייז די ראָלע פון ​​SPECC1L אויף די סעליאַלער מדרגה, מיר געוויינט די פריער דיסקרייבד סטאַביל אָסטעאָסאַרקאָמאַ צעל שורה U2OS דיפישאַנט אין SPECC1L18.די סטאַביל ו2אָס סעלז מיט SPECC1L (kd) נאַקדאַון האט אַ מעסיק (60-70%) פאַרקלענערן אין די לעוועלס פון SPECC1L טראַנסקריפּץ און פּראָטעינס, צוזאמען מיט חסרונות אין מייגריישאַן און ריאָרגאַנאַזיישאַן פון די אַקטין סיטאָסקעלעטאָן 18. אין קאַנטראַסט, אַ שטרענג טראַנזשאַנט פאַרקלענערן אין SPECC1L איז געוויזן צו פירן צו מיטאָטיש חסרונות 23.נאָך מער קעראַקטעריסטיקס, מיר געפֿונען אַז אונדזער סטאַביל SPECC1L-kd סעלז האָבן געביטן מאָרפאַלאַדזשי אין אַ זייער הויך קאַנפלואַנס (פיגורע 1).יחיד קאָנטראָל סעלז און קד סעלז אין נידעריק קאַנפלואַנס געקוקט ענלעך (פיגורע 1 אַ, ד).24 שעה נאָך פוסיאָן, קאָנטראָל סעלז ריטיינד זייער קובאָידאַל פאָרעם (Fig. 1B, E), בשעת SPECC1L-kd סעלז ילאָנגגייטאַד (Fig. 1C, F).די מאָס פון דעם ענדערונג אין צעל פאָרעם איז קאַפּטשערד דורך אין וויוואָו לעבן ימאַגינג פון קאָנטראָל סעלז און קד סעלז (פֿילם 1).צו באַשטימען די ראָלע פון ​​SPECC1L אין קאַנפלואַנט סעלז, מיר ערשטער יגזאַמאַנד זייַן אויסדרוק.מיר געפֿונען אַז SPECC1L פּראָטעין לעוועלס געוואקסן נאָך פוסיאָן (פיגורע 1G), כאָטש SPECC1L טראַנסקריפּט לעוועלס זענען נישט געוואקסן (פיגורע 1H).אין דערצו, ווי צעל געדיכטקייַט געוואקסן, SPECC1L פּראָטעין אַקיומיאַלייטיד אין ינטערסעללולאַר באַונדריז (Fig. 2A-E), מיט אַ מוסטער אָוווערלאַפּינג מיט אַז פון מעמבראַנע-פארבונדן β-קאַטענין (Fig. 2A'-E').לויט דער פאַרבאַנד פון SPECC1L מיט די אַקטין סיטאָסקעלעטאָן 18,23, מיר כייפּאַטאַסייזד אַז SPECC1L ינטעראַקץ מיט אַקטין-באזירט קלעפּיק דזשונקטיאָנס (AJ).
(AF) SPECC1L נאַקדאַון (DF) סעלז ילאָנגגייט ביי הויך קאַנפלואַנס (F) קאַמפּערד מיט קאָנטראָל U2OS סעלז (AC).געוויזן דאָ זענען דריי פון די זעקס צייט פונקטן (T1, T3, T6) וואָס מיר האָבן אויסגעקליבן פֿאַר פאַרשידענע צעל געדיכטקייַט.(ג) מערב בלאָט אַנאַליסיס וואָס ווייַזן אַז די SPECC1L פּראָטעין איז סטייבאַלייזד אין אַ הויך גראַד פון קאַנפלואַנס קאַמפּערד צו אַ נידעריק גראַד פון קאַנפלואַנס אין קאָנטראָל סעלז.מערב בלאָט פון SPECC1L ווייזט די דערוואַרט 120 kDa באַנד און אַ העכער מאָלעקולאַר וואָג באַנד, עפשער פּאָסט-טראַנסלאַטיאָנאַללי מאַדאַפייד (*).מערב בלאָט אַנאַליסיס איז דורכגעקאָכט אונטער די זעלבע באדינגונגען פֿאַר נידעריק און הויך קאַנפלואַנס.בילדער וואָס ווייַזן SPECC1L ביי נידעריק און הויך קאַנפלואַנס זענען גענומען פֿון דער זעלביקער בלאָט.דער זעלביקער בלאָט איז אַוועקגענומען און שייַעך-יקסאַמיינד מיט β-אַקטין אַנטיבאָדי.(ה) קוואַנטיטאַטיווע RT-PCR אַנאַליסיס געוויזן קיין באַטייַטיק ענדערונגען אין SPECC1L טראַנסקריפּט לעוועלס.טעות באַרס רעפּראַזענץ סעמס פון פיר פרייַ יקספּעראַמאַנץ.
(AE) מיר אויסדערוויילט זעקס צייט פונקטן (T1-T6) רעפּריזענטינג אַ קייט פון צעל דענסיז צו נאָרמאַלייז צעל פאָרעם אַנאַליסיס און AJ ענדערונגען אין U2OS סעלז מיט SPECC1L נאַקדאַון (קד).די ערשטע פינף פון די צייט ווייזט אַרייַנגערעכנט איין סעלז (ט 1), 50-70% פוסיאָן פון קליין צעל קלאַסטערז (ט 2), פוסיאָן אָן רישאַפּינג קד סעלז (ט 3), רישאַפּינג קד סעלז (ט 4), און 24 שעה ענדערונגען.אין די שפּעטערדיק פאָרעם פון קד (ט 5) סעלז.די SPECC1L פּראָטעין איז פּרידאַמאַנאַנטלי דיספּערסט אין די סיטאָפּלאַסם ביי ט 1 (א), אָבער זיין אַקיומיאַליישאַן איז באמערקט ביי ינטערסעללולאַר באַונדריז אין סאַבסאַקוואַנט צייט פונקטן (B-E, אַראָוז).(FJ) β-קאַטענין ווייזט ענלעך אַקיומיאַליישאַן אין ינטערסעללולאַר באַונדריז פֿאַרבונדן מיט די AJ קאָמפּלעקס.(A'-E') SPECC1L און β-קאַטענין ווייַזן אָוווערלאַפּינג סטיינינג אין צעל געמארקן אין הויך צעל געדיכטקייַט (אַראָוז).(F'-J') אין SPECC1L-kd סעלז, β-קאַטענין סטיינינג איז נאָרמאַל ביי נידעריק צעל געדיכטקייַט (F'-H'), אָבער יקספּאַנדז ווי צעל פאָרעם ענדערונגען (I', J'; אַראָוז), וואָס ינדיקייץ אַז AJ האָבן געביטן.באַרס = 10 μם.
דערנאָך מיר געפרוווט צו באַשליסן די ווירקונג פון SPECC1L דיפישאַנסי אויף AJ.מיר האָבן גענוצט עטלעכע AJ-פארבונדן מאַרקערס, אַרייַנגערעכנט די קאַנאָניקאַל קאַמפּאָונאַנץ F-אַקטין, מיאָסין IIb, β-קאַטענין און E-קאַדהערין24,25,26,27.אַקטין דרוק פייבערז געוואקסן אין SPECC1L-kd סעלז ווי דיסקרייבד פריער (Fig. 3A, B) 18.Myosin IIb פֿאַרבונדן מיט אַקטין פילאַמאַנץ געוויזן אַ ענלעך פאַרגרעסערן אין SPECC1L-kd סעלז אין וויטראָ (Fig. 3C, D).אַדזש-פארבונדן β-קאַטענין ביינדז צו קאַדהערין אין דער צעל מעמבראַנע, ווייַזונג אַ נאָרמאַל "כאַניקאָמב" אויסדרוק מוסטער אין קאָנטראָל קואָסיטעס (Fig. 3E,G).ינטערעסטינגלי, אין פלאַך בילדער ניצן קאָנפאָקאַל מיקראָסקאָפּי, β-קאַטענין (Fig. 3E, F) און E-קאַדהערין (Fig. 3G, H) סטיינינג אויף די צעל מעמבראַנע פון ​​קאַנפלואַנט ספּעקק1ל-דיפישאַנט סעלז געוויזן באַוווסט פּאַטערנז פון עקסטענדעד סטיינינג.דעם יקספּאַנשאַן פון אַדזש-פארבונדן β-קאַטענין סטיינינג אין קד סעלז איז מערסט פּראַנאַונסט אין קאַנפלואַנס, אָבער ארויס צו פאָרויסיקע ווייַזונג ענדערונגען אין צעל פאָרעם (Fig. 2F-J, F'-J').צו באַשטימען די גשמיות נאַטור פון דעם עקסטענדעד AJ סטיינינג, מיר יגזאַמאַנד צעל געמארקן אויף די אַפּיקאַל-בייסאַל ייבערפלאַך פון SPECC1L-kd U2OS סעלז דורך טראַנסמיסיע עלעקטראָן מיקראָסקאָפּי (TEM) (פיגורע 3I,J).אין קאַנטראַסט צו קאָנטראָל סעלז (Fig. 3I), וואָס האט באַזונדער עלעקטראָן געדיכט מקומות ינדיקאַטיוו פון אַדזש (אַראָוז), קד סעלז (Fig. 3J) געוויזן גרויס, קאַנטיגיואַס מקומות פון הויך עלעקטראָן געדיכטקייַט ינדיקאַטיוו פון אַדזש צוזאמען די אַפּיקאָבאַסאַל פלאַך..אין דערצו, אויף טראַנזווערס סעקשאַנז, מיר באמערקט ברייט צעל מעמבראַנע פאָולדז אין קד סעלז (Fig. S1A, B), וואָס דערקלערט די עקסטענדעד מוסטער פון β-קאַטענין און E-קאַדהערין סטיינינג באַנדס (Fig. 3F, H).אין שטיצן פון די ראָלע פון ​​SPECC1L אין AJs, β-קאַטענין איז געווען קאָ-יממונאָפּרעסיפּיטאַטעד מיט SPECC1L אין ליסאַטעס פון קאַנפלואַנט ו2אָס סעלז (Fig. 3K).צוזאַמען מיט עקסטענדעד ימיונאַסטיינינג פֿאַר AJ מאַרקערס, TEM אַנאַליסיס איז געווען קאָנסיסטענט מיט אונדזער כייפּאַטאַסאַס אַז SPECC1L דיפישאַנסי ינקריסאַז די אַפּיקאַל-בייסאַל געדיכטקייַט און דיפעראַנסיז פון AJ.
(אַה) ינקרעאַסעד פ-אַקטין סטיינינג אין קד סעלז אין 48 שעה נאָך פוסיאָן (ט 6; א, ב).אָלטערד סטיינינג פון מיאָסין IIb פֿאַרבונדן מיט F-אַקטין (C, D).די גלאַט מוסטער פון β-קאַטענין און E-קאַדהערין מעמבראַנע סטיינינג אין קאָנטראָל סעלז (E, G) איז ענכאַנסט אין SPECC1L-kd (F, H) סעלז.באַרס = 10 μם.(I-J) עלעקטראָן מיקראָגראַפס אַבזערווינג די אַפּיקאַל-בייסאַל ינטערסעללולאַר קנופּ.קאָנטראָל סעלז ווייַזן בוילעט עלעקטראָן-געדיכט מקומות וואָס ינדיקייץ קלעפּיק דזשונקטיאָנס (איך, אַראָוז).אין קאַנטראַסט, די גאנצע אַפּיקאַל-בייסאַל קנופּ אין SPECC1L-kd סעלז ארויס עלעקטראָן געדיכט (דזש, אַראָוז), ינדאַקייטינג געוואקסן געדיכטקייַט און דיספּערסיאָן פון קלעפּיק דזשונקטיאָנס.(ק) β-קאַטענין איז קאָ-יממונאָפּרעסיפּיטאַטעד מיט SPECC1L אין קאַנפלואַנט ו2אָס צעל ליסיז.בילד גענומען פון איין אָרט רעפּריזענטינג איינער פון פיר פרייַ יקספּעראַמאַנץ.
צו פֿאַרשטיין די ראָלע פון ​​SPECC1L אין קראַניאָפאַסיאַל מאָרפאָגענעסיס, מיר באשאפן אַ ספּעקק1ל דיפישאַנט מויז מאָדעל ניצן צוויי פרייַ ES טראַפּ צעל שורות, DTM096 און RRH048 (BayGenomics, CA), וואָס רעפּראַזענץ ינטראָן 1 און ספּעקק1ל טראַנסקריפּץ זענען קאַפּטשערד ביי 15 (פיגורע 1). .4 א, פיגור ס 2).די גענאָמיק אָרט פון די דעקוי וועקטאָר אַרייַנלייגן איז באשלאסן דורך גאַנץ גענאָמע סיקוואַנסינג און באשטעטיקט דורך פּקר (Fig. S2).ביידע דזשין טראַפּ דיזיינז אויך ערלויבט אין-ראַם פוסיאָן פון די Specc11-lacZ רעפּאָרטערס ביי כאַפּן.דעריבער, lacZ אויסדרוק באשלאסן דורך X-גאַל סטיינינג איז געווען געניצט ווי אַ גראדן פון ספּעקק11 אויסדרוק.ביידע אַללעס געוויזן ענלעך lacZ אויסדרוק פּאַטערנז, מיט די DTM096 דזשין טראַפּ אין ינטראָן 1 ווייזונג שטארקער אויסדרוק ווי RRH048 אין ינטראָן 15 (ניט געוויזן).אָבער, Specc1l איז וויידלי אויסגעדריקט, מיט דער הויפּט שטאַרק אויסדרוק אין די נעוראַל פאָולדז ביי E8.5 (פיגורע 4B), אין די נעוראַל רער און פאַסיאַל פּראַסעסאַז ביי E9.5 און E10.5 (Figure 4C,D), און אין דעוועלאָפּינג לימז. ביי E10.5 און אויגן (פיגורע 4 ד).מיר פריער געמאלדן אַז SPECC1L אויסדרוק אין דער ערשטער פאַרינגעאַל כיטרע ביי E10.5 איז געווען פאָרשטעלן אין די עפּיטהעליום און אַנדערלייינג מעסענטשימע18, קאָנסיסטענט מיט די CNCC ייכעס.צו פּרובירן SPECC1L אויסדרוק אין CNCC, מיר דורכגעקאָכט ע8.5 נעוראַל פאָולדז (פיגורע 4E-J) און E9.5 שאַרבן סעקשאַנז (פיגורע 4K-).אין E8.5, SPECC1L סטיינד נעוראַל פאָולדז ינטענסלי (Fig. 4E, H), אַרייַנגערעכנט סעלז סטיינד מיט נקק מאַרקערס (Fig. 4G, J).אין E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) שטארק סטיינד מייגרייטינג קנקק קאָ-סטיינד מיט AP2A (Fig. 4L, M) אָדער SOX10 (Fig. 4O, P).
(א) סכעמאַטיש פאַרטרעטונג פון די מויז ספּעקק11 דזשין ווייזונג דעקוי וועקטאָר ינסערשאַן אין ES DTM096 (ינטראָן 1) און RRH048 (ינטראָן 15) צעל קלאָונז.(BD) lacZ סטיינינג פון העטעראָזיגאָוס ספּעקק1לדטמ096 עמבריאָוז רעפּריזענטינג ספּעקק1ל אויסדרוק פון E8.5 צו E10.5.נע = נעוראָעקטאָדערם, נף = נעוראַל פאַרלייגן, פּאַ1 = ערשטער פאַרינגעאַל כיטרע.(EP) SPECC1L ימיונאַסטיינינג מיט NCC מאַרקערס AP2A און SOX10 אין E8.5 (NF; EJ) נעוראַל פאָולדז און E9.5 (KP) שאַרבן סעקשאַנז.SPECC1L סטיינינג איז וויידלי באמערקט אין נעוראַל פאָולדז E8.5 (E, H; arrowheads), אַרייַנגערעכנט סעלז מיטן נאָמען AP2A (F, G; arrowheads) און SOX10 (I, J; arrowheads).ביי E9.5, SPECC1L שטארק סטיינד מייגרייטינג CNCCs (K, N; אַראָוז) מיטן נאָמען AP2A (L, M; אַראָוז) און SOX10 (O, P; אַראָוז).
אַריבער צווישן העטעראָזיגאָס ספּעקק1לדטמ096 /+ און ספּעק1לרה048 /+ מיסע ווייזט אַז די צוויי דזשין טראַפּ אַללעס זענען נישט קאַמפּלאַמענטשי און אַז קאַמפּאַונד העטעראָזיגאָטעס און עמבריאָניק האָמאָזיגאָטעס פֿאַר יעדער דזשין טראַפּ אַללע זענען עמבריאָניק טויטלעך (טאַבלע ס 1).מענדעליאַן ריישיאָוז אנגעוויזן אַ פאַרקלענערן אין די ניצל קורס פון העטעראָזיגאָטעס ביי געבורט (געריכט 1.34 ווס. 2.0).מיר באמערקט נידעריק פּערינאַטאַל מאָרטאַליטי צווישן העטעראָזיגאָטעס, עטלעכע האָבן קראַניאָפאַסיאַל אַנאַמאַליז (Fig. S3).אָבער, די נידעריק פּענעטראַנס פון די פּערינאַטאַל קראַניאָפאַסיאַל פענאָטיפּעס מאכט עס שווער צו לערנען זייער אַנדערלייינג פּאַטהאָפיסיאָלאָגיקאַל מעקאַניזאַמז.דעריבער, מיר פאָוקיסט אויף די עמבריאָניק טויטלעך פענאָטיפּע פון ​​האָמאָזיגאָוס ספּעקק11 מיוטאַנץ.
רובֿ קאַמפּאַונד העטעראָזיגאָוס אָדער האָמאָזיגאָוס ספּעק1לדטמ096/ררה048 מיוטאַנט עמבריאָוז האט נישט אַנטוויקלען נאָך E9.5-10.5 (פיגס. 5A-D), און די נעוראַל רער האט נישט נאָענט אַנטיריערלי (Figs. 5B, D) און מאל פארמאכט פּאָסטערערלי (ניט געוויזן) ..דעם קראַניאַל נעוראַל רער קלאָוזשער כיסאָרן איז געווען פארבונדן מיט די מערהייַט פון CNCC אנגעצייכנט DLX2 רוען אין די נעוראַל פאָולדז ביי E10.5, ינדאַקייטינג קיין דייסעקשאַן (פיגורע 5A'-D').צו באַשליסן אויב די קוילעלדיק גרייס פון CNCC איז אויך רידוסט, מיר טאַגד CNCC שורות מיט GFP אין אונדזער דזשין טראַפּ שורות מיט Wnt1-Cre און ROSAmTmG.מיר סטרימינג אויסגעשטעלט GFP + NCC און GFP- (RFP +) ניט-NCC פֿון גאַנץ עמבריאָוז.ביי E9.5, די פּראָפּאָרציע פון ​​לויפן-סאָרטיד GFP-לייבאַלד CNCCs האט נישט באטייטיק געביטן צווישן WT און מוטאַנט עמבריאָוז (ניט געוויזן), וואָס ינדיקייץ נאָרמאַל CNCC באַשרייַבונג.דעריבער, מיר כייפּאַטאַסייזד אַז ריזידזשואַל Wnt1-Cre און DLX2 סטיינינג אין יקספּאָוזד נעוראַל פאָולדז (פיגורע 5 ב ') איז געווען רעכט צו דעפעקטיווע CNCC לייערינג, עפשער רעכט צו געוואקסן געדיכטקייַט אָדער דיספּערשאַן פון AJ סעלז, ווי געזען אין SPECC1L-kd סעלז.מיר געוויינט די NCC מאַרקערס SOX10, AP2A און DLX2 צו באַשטעטיקן דעם בייַזייַן פון CNCC אין די נעוראַל פאַרלייגן (פיגורע 5E-R).אין E8.5, נעוראַל פאַרלייגן סטיינינג פֿאַר אַלע דריי נקק מאַרקערס איז באמערקט אין סעקשאַנז פון ווט (Fig. 5E, G, I) און Specc1l מוטאַנט (Fig. 5F, H, J).אין E9.5, בשעת נקק מאַרקערס סטיינד מייגרייטינג נקק אין ווט סעקשאַנז (Fig. 5M, O, Q), ריזידזשואַל נקק סטיינינג איז באמערקט אין יקספּאָוזד נעוראַל פאָולדז פון ספּעק1ל מוטאַנט עמבריאָוז (Fig. 5N, P, R).ווייַל SOX10 און DLX2 צייכן מייגרייטינג CNCCs, דער רעזולטאַט סאַגדזשעסץ אַז SPECC1L-דיפישאַנט CNCCs דערגרייכן פּאָסט-מיגראַטאָרי ספּעסאַפאַקיישאַנז אָבער פאַרלאָזן צו מייגרייט פון נעוראַל פאָולדז.
ספּעק11 דיפישאַנסי פירט צו דעפעקטיווע נעוראַל רער קלאָוזשער, דעלאַמינאַטיאָן פון קראַניאַל נעוראַל קאַם סעלז און אַדזשס.
(א, ב') E9.5 WT (א) עמבריאָ קעריינג מייגרייטינג קראַניאַל נעוראַל קאַם סעלז (CNCC) מיטן נאָמען Wnt1-Cre (A').אין קאַנטראַסט, Specc11 מיוטאַנט עמבריאָוז ווייַזן עפענען נעוראַל פאָולדז (ב), arrowheads און CNCCs וואָס האָבן נישט מייגרייטיד (B', arrowheads).(C, D') העל פעלד בילדער (C, D') און ימיונאַסטיינינג (C', D') פון די CNCC מאַרקער DLX2 פון E10.5 WT עמבריאָוז (C, C') און Specc1l (D, D').אין WT E10.5 עמבריאָוז, DLX2-positive CNCC קאַלאַנייז די גיל אַרטשעס (C', אַראָוז), בשעת אין מיוטאַנץ, אָנזעעוודיק סטיינינג בלייַבט אין די עפענען נעוראַל פאָולדז (D', אַראָוז) און אין דער ערשטער פאַרינגעאַל אַרטשעס (D', אַראָוז).) מיט עטלעכע סטיינינג (אַראָוז) ינדאַקייטינג נעבעך דעלאַמינאַטיאָן און מייגריישאַן פון קנקק.ER) סעקשאַנז פון WT און Specc1l מוטאַנט עמבריאָוז אין סטאַגעס E8.5 (E-L) און E9.5 (M-R) זענען לייבאַלד מיט NCC מאַרקערס SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, אָ, פּ) און דלקס2 ​​(איך, דזש, ק, ר).ביי E8.5, NCC סטיינינג איז באמערקט אין ווילד-טיפּ נעוראַל פאַרלייגן (NF) און מוטאַנט סעקשאַנז.קאָ-סטיינינג פון SOX10 און β-קאַטענין אין E8.5 WT (K) און מוטאַנט (ל) גילוי געוואקסן β-קאַטענין סטיינינג ביי צעל באַונדריז אין די נעוראַל פאָולדז.ביי E9.5, ווילד-טיפּ סטיינינג פון מייגרייטינג CNCCs (M, O, Q) איז באמערקט, בשעת אין מיוטאַנץ, ונסטראַטיפיעד CNCCs סטיינד עפענען נעוראַל פאָולדז (N, P, R).(S – Z) אין וויוואָו אַדזש לייבלינג אַנאַליסיס אין קאָראָנאַל סעקשאַנז פון WT און Specc11DTM096 / RRH048 עמבריאָוז מיט די E9.5 מיוטיישאַן.אַ דערנענטערנ סעקשאַנאַל פלאַך איז געוויזן אין דער אויבערשטער רעכט ווינקל.אין סעקשאַנז פון מוטאַנט געוועבן, געוואקסן סטיינינג פון F-אַקטין (S, T) און מיאָסין IIb (U, V) איז באמערקט.ענלעך צו די אין וויטראָ רעזולטאטן אין פייג. 3, אין מיוטאַנט עמבריאָוז, ימפּרוווד מעמבראַנע סטיינינג פֿאַר β-קאַטענין (וו, רענטגענ) און E-קאַדהערין (י, ז) איז באמערקט.(AA-BB) אַן עלעקטראָן מיקראָגראַף פון אַ אָפּטיילונג פון אַ ווילד-טיפּ עמבריאָ קוקן ווייַטער פון די גרענעץ פון די אַפּיקאַל-בייסאַל צעל ווייזט אַ באַזונדער עלעקטראָן-געדיכט געגנט ינדיקייץ קלעפּיק דזשונקטיאָנס (אַאַ, אַראָוז).אין קאַנטראַסט, אין סעקשאַנז פון Specc11 מוטאַנט עמבריאָוז (BB, אַראָוז), די גאנצע אַפּיקאָבאַסאַל קנופּ איז עלעקטראָן געדיכט, ינדאַקייטינג אַ געוואקסן געדיכטקייַט און דיספּערסיאָן פון קלעפּיק דזשונקטיאָנס.
צו פּרובירן אונדזער כייפּאַטאַסאַס אַז רידוסט לייערינג איז רעכט צו אָלטערד אַדזש, מיר יגזאַמאַנד אַדזש לייבלינג אין יקספּאָוזד נעוראַל פאָולדז פון ספּעק1ל מוטאַנט עמבריאָוז (פיג. 5 ס-ז).מיר באמערקט אַ פאַרגרעסערן אין אַקטין דרוק פייבערז (Fig. 5S, T) און אַ קאַנקאַמיטאַנט געוואקסן לאָוקאַלאַזיישאַן פון מיאָסין יב סטיינינג אויף אַקטין פייבערז (Fig. 5U, V).ימפּאָרטאַנטלי, מיר באמערקט געוואקסן סטיינינג פון β-קאַטענין (Fig. 5W, X) און E-קאַדהירין (Fig. 5Y, Z) אין ינטערסעללולאַר באַונדריז.מיר אויך יגזאַמאַנד β-קאַטענין סטיינינג פון נקק אין די נעוראַל פאָולדז פון ע8.5 עמבריאָוז (Fig. 5K, L).β-קאַטענין סטיינינג איז געווען שטארקער אין ספּעק1ל מוטאַנט נעוראַל פאָולדז (פיג. 5 ל און ק), סאַגדזשעסטינג אַז אַדזש ענדערונגען האָבן אנגעהויבן.אין עלעקטראָן מיקראָגראַפס פון שאַרבן סעקשאַנז פון ע9.5 עמבריאָוז, מיר ווידער באמערקט געוואקסן דיפיוז עלעקטראָן-געדיכט סטיינינג אין ספּעק1ל מוטאַנט עמבריאָוז קאַמפּערד צו ווט (פיג. 5אַאַ, בב און ס1ע-ה).צוזאַמען, די רעזולטאַטן שטיצן אונדזער אין וויטראָ רעזולטאטן אין SPECC1L-kd U2OS סעלז און פֿאָרשלאָגן אַז אַבעראַנט AJ סטיינינג פּריסידז CNCC סטראַטיפיקאַטיאָן אין אונדזער מוטאַנט עמבריאָוז.
געגעבן די באַוווסט אַנטאַגאַנאַסטיק שייכות צווישן AKT טעטיקייט און E-קאַדהערין פעסטקייַט, 17,28 מיר כייפּאַטאַסייזד די ינוואַלוומאַנט פון PI3K-AKT סיגנאַלינג.אין אַדישאַן, מיר באמערקט סובעפּידערמאַל בליסטערינג אין עטלעכע פון ​​אונדזער מוטאַנט עמבריאָוז וואָס אנטרונען טויט (<5%) ביי E9.5-10.5 און אַנשטאָט געזעצט אַרום E13.5 (Fig. S3).סובעפּידערמאַל וועסיקלעס זענען אַ כאַלמאַרק פון רידוסט PI3K-AKT סיגנאַלינג באזירט אויף PDGFRα12.פאַנטאַוזזאָ עט על.(2014) געמאלדן אַז דיסראַפּשאַן פון PDGFRα-באזירט PI3K אַקטאַוויישאַן אין PdgfraPI3K / PI3K מוטאַנט עמבריאָוז רעזולטאַטן אין סובעפּידערמאַל וועסיקאַלז, נעוראַל רער חסרונות און פענאָטיפּעס פון שפּאַלטן גומען.טאקע, לעוועלס פון פּאַן-אַקט און אַקטיוו פאָספאָרילאַטעד סער473-אַקט זענען רידוסט אין וויוואָו אין ספּעקק1ל מוטאַנט געוועבן צו ע9.5 עמבריאָניק אַרעסט (Fig. 6A-D).די פאַרקלענערן אין לעוועלס פון פאָספאָרילאַטעד סער473-אַקט קען זיין לעגאַמרע רעכט צו דער פאַרקלענערן אין לעוועלס פון פּאַן-אַקט אין וויוואָו (FIG. 6E) און אין וויטראָ (FIG. 6F).אַן אין וויטראָ פאַרקלענערן איז באמערקט בלויז ווען U2OS סעלז זענען שטארק קאַנפלואַנט מיט ענדערונגען אין צעל פאָרעם און AJ געדיכטקייַט (פיגורע 6 ד).אזוי, אונדזער דאַטן פֿאָרשלאָגן אַז SPECC1L איז אַ ראָמאַן positive רעגולאַטאָר פון PI3K-AKT סיגנאַלינג אין קראַניאָפאַסיאַל מאָרפאָגענעסיס.
(A – E) E8.5 (A, B) און E9.5 (C, D) שאַרבן סעקשאַנז אָדער E9.5 ליסאַטעס פון Specc1l מוטאַנט עמבריאָוז (E) ווייַזונג לעוועלס פון אַקטיוו פאָספאָרילאַטעד S473-AKT און Pan-AKT פּראָטעין רעדוקציע , קאַמפּערד צו קאָנטראָל ווט.מערב בלאָטינג איז דורכגעקאָכט אויף ווילד-טיפּ ליסאַטעס און מוטאַנט ליסאַטעס אונטער די זעלבע באדינגונגען.די בילדער געוויזן פֿאַר SPECC1L זענען גענומען פֿון איין בלאָט.דער זעלביקער בלאָט איז אַוועקגענומען און שייַעך-יקסאַמיינד מיט אַנטי-פּאַן-אַקט און β-אַקטין אַנטיבאָדיעס.Pan-AKT לעוועלס אין E8.5 נעוראַל פאָולדז (א, ב) און לעוועלס פון פאָספאָרילאַטעד S473-AKT אין E9.5 שאַרבן סעקשאַנז זענען באטייטיק רידוסט.(F) Pan-AKT לעוועלס זענען סימילאַרלי רידוסט אין ליסאַטעס פון SPECC1L-kd U2OS סעלז כאַרוואַסטיד אין הויך קאַנפלואַנס.טעות באַרס רעפּראַזענץ סעמס פון דריי פרייַ מערב בלאָט קוואַנטאַפאַקיישאַנז.(GJ) סעקשאַנז פון WT עמבריאָוז ביי E9.5 סטיינד מיט KI67 און קלעאַוועד קאַספּאַסע 3, ריספּעקטיוולי, ווייַזונג צעל פּראָוליפעריישאַן (G, G') און קליין אַפּאָפּטאָטיק טעטיקייט (H, H').Specc11 מיוטאַנט עמבריאָוז ווייַזן פאַרגלייַכלעך צעל פּראָוליפעריישאַן (איך), אָבער די נומער פון סעלז אַנדערגאָו אַפּאָפּטאָסיס איז באטייטיק געוואקסן (דזש).
מיר דערנאָך יגזאַמאַנד מאַרקערס פון פּראָוליפעריישאַן און אַפּאָפּטאָסיס.מיר האָבן נישט אָבסערווירן קיין חילוק אין די פּראָוליפעריישאַן פון E9.5 עמבריאָוז (Fig. 6E, G קאַמפּערד מיט איך) מיט אַ פּראָוליפעריישאַן אינדעקס פון 82.5% פֿאַר ווט מיוטאַנץ און 86.5% פֿאַר ספּעק1ל מיוטאַנץ געמאסטן דורך KI67 סטיינינג (פּ <0.56, Fisher's פּינטלעך פּרובירן).סימילאַרלי, מיר האָבן נישט אָבסערווירן קיין חילוק אין אַפּאָפּטאָסיס געמאסטן דורך סטיינינג פֿאַר קלעאַוועד קאַספּאַסע 3 אין נעוראַל פאָולדז ביי E8.5 ביז עמבריאָ אַרעסט (ניט געוויזן) (ניט געוויזן).אין קאַנטראַסט, אַפּאָפּטאָסיס איז באטייטיק געוואקסן אין אַלע ע9.5 מיוטאַנט עמבריאָוז (Fig. 6F, H און J).די קוילעלדיק פאַרגרעסערן אין אַפּאָפּטאָסיס איז קאָנסיסטענט מיט רידוסט PI3K-AKT סיגנאַלינג און פרי עמבריאָניק לעטאַלאַטי 29,30,31.
דערנאָך, צו באַשטעטיקן אַ קאַוסאַל ראָלע פֿאַר PI3K-AKT סיגנאַלינג אין AJ ענדערונגען אין אונדזער קד סעלז, מיר כעמיש אָלטערד די פּאַטוויי אין קאָנטראָל און קד סעלז (פיגורע 7A-F).מיר געוויינט ווי אַ מאַרקער די פענאָטיפּע פון ​​​​ענדערונג פון צעל פאָרעם באמערקט אין קאַנפלואַנט SPECC1L-kd סעלז, וואָס מיר קוואַנטאַפייד ניצן די פאַרהעלטעניש פון די לאָנגעסט ויסמעסטונג (לענג) צו די קאָראַספּאַנדינג ווערטיקאַל ויסמעסטונג (ברייט).א פאַרהעלטעניש פון 1 איז געריכט פֿאַר לעפיערעך קייַלעכיק אָדער קובאָידאַל סעלז (פיגורע 7 ג).אין דערצו צו צעל פאָרעם, מיר אויך באשטעטיקט די ווירקונג אויף אַדזש דורך β-קאַטענין סטיינינג (Fig. 7A'-F').ינאַבישאַן פון די PI3K-AKT פּאַטוויי ניצן וואָרטמאַננין איז גענוג צו טוישן צעל פאָרעם אין קאָנטראָל סעלז (פיגורע 7A, C) און AJ (Figure 7A').PI3K-AKT אַקטיוואַטאָר סק-79 האט נישט ווירקן צעל פאָרעם (FIG. 7A, E) אָדער AJ יקספּאַנשאַן (FIG. 7A') אין קאָנטראָל סעלז.אין SPECC1L-kd סעלז, ווייַטער סאַפּרעשאַן פון די PI3K-AKT פּאַטוויי ריזאַלטיד אין געוואקסן אַפּאָפּטאָסיס (Fig. 7B, D) און אַ אנגעצייכנט פאַרגרעסערן אין β-קאַטענין סטיינינג (Fig. 7B'), קאָנסיסטענט מיט אונדזער אין וויוואָו שווער מיוטאַנץ.ימפּאָרטאַנטלי, אַקטאַוויישאַן פון די PI3K-AKT פּאַטוויי באטייטיק ימפּרוווד צעל פאָרעם (פיגורע 7B, F) און AJ פענאָטיפּעס (פיגורע 7B").ענדערונגען אין צעל פאָרעם זענען קוואַנטאַפייד ווי צעל ראָונדנעסס פאַרהעלטעניש (CCR) און קאַמפּערד פֿאַר באַטייַט ווי דיסקרייבד אויבן (FIG. 7G).טאקע, אין קאָנטראָל סעלז (Fig. 7G, CCR = 1.56), וואָרטמאַנין באַהאַנדלונג איז גענוג צו באטייטיק יבערבייַטן די צעל פאָרעם (Fig. 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) צו די מאָס ענלעך צו די באמערקט. אין SPECC1L.-קד סעלז (Fig. 7G, CCR = 3.46).וואָרטמאַננין באַהאַנדלונג פון SPECC1L-kd סעלז (Fig. 7G, CCR = 3.60, נעגלאַדזשאַבאַל) איז געווען ניט מער באַטייַטיק ווי אַנטריטיד קד סעלז (Fig. 7G, CCR = 3.46, נעגלאַדזשאַבאַל) אָדער וואָרטמאַנין-באהאנדלט קאָנטראָל סעלז (Fig. 7G)., CCR = 3.46, נעגלאַדזשאַבאַל) אַדישנאַלי אַפעקץ צעל ילאָנגגיישאַן (7G, CCR = 3.61, נעגלאַדזשאַבאַל).רובֿ ימפּאָרטאַנטלי, SC-79 AKT אַקטיוואַטאָר געזונט די ילאָנגגייטאַד פענאָטיפּע פון ​​SPECC1L-kd סעלז (Fig. 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).די רעזולטאַטן באַשטעטיקן אַז SPECC1L רעגיאַלייץ PI3K-AKT סיגנאַלינג און פֿאָרשלאָגן אַז אַ מעסיק פאַרקלענערן אין SPECC1L אַפעקץ צעל אַדכיזשאַן, בשעת אַ שטאַרק פאַרקלענערן פירט צו אַפּאָפּטאָסיס (Fig. 8).
(A–F') קאָנטראָל (A, C, E) און SPECC1L-kd (B, D, F) סעלז באהאנדלט מיט PI3K-AKT פּאַטוויי ינכיבאַטער וואָרטמאַנין (C, D) אָדער SC-79 אַקטיוואַטאָר (E, F) באַהאַנדלונג אַנטריטיד קאָנטראָל סעלז זענען קובאָידאַל (א) מיט נאָרמאַל β-קאַץ סעליאַלער סטיינינג (א'), בשעת קד סעלז זענען ילאָנגגייטאַד (ב) מיט געוואקסן β-קאַץ סטיינינג (ב').נאָך סאַפּרעשאַן פון די PI3K-AKT פּאַטוויי, קאָנטראָל סעלז ילאָנגגייטאַד (C) מיט β-קאַץ יקספּאַנשאַן (C'), בשעת קד סעלז אנגעהויבן צו אַנדערגאָו אַפּאָפּטאָסיס (ד), ענלעך צו אונדזער העכסט מיוטייטיד עמבריאָוז און ווייַזן גאָר ענכאַנסט β-קאַץ.סטיינינג (ד ').נאָך אַקטאַוויישאַן פון די PI3K-AKT פּאַטוויי, קאָנטראָל סעלז פארבליבן קובאָידאַל (E) און האָבן נאָרמאַל β-קאַץ (E') סטיינינג, בשעת קד סעלז געוויזן באטייטיק ימפּרוווד צעל פאָרעם (F) און β-קאַץ (F') סטיינינג, ינדאַקייטינג (ג) דער גראַד פון צעל פאָרעם ענדערונג אין (AF) איז קוואַנטאַפייד ניצן די צעל ראָונדנעסס פאַרהעלטעניש (CCR) פון די לאָנגעסט ויסמעסטונג (לענג) און די קאָראַספּאַנדינג ווערטיקאַל ויסמעסטונג (ברייט) ניצן MetaMorph ווייכווארג.אַנטריטיד (נט) SPECC1L-kd סעלז (CCR = 3.46) זענען באטייטיק מער ווי קאָנטראָל סעלז (CCR = 1.56, פּ <6.1 × 10-13).וואָרט ס ינאַבישאַן פון די PI3K-AKT פּאַטוויי אין קאָנטראָל סעלז איז גענוג צו פאַרשאַפן אַ ענלעך ילאָנגגיישאַן אין צעל פאָרעם (CCR = 3.61, פּ <2.4 × 10-9).סימילאַרלי, AKT אַקטאַוויישאַן דורך SC-79 אין SPECC1L-kd סעלז געזונט ילאָנגגיישאַן פון צעל צו קאָנטראָל לעוועלס (CCR = 1.74, פּ <6.2 × 10-12).וואָרטמאַננין באַהאַנדלונג פון SPECC1L-kd סעלז ריזאַלטיד אין געוואקסן אַפּאָפּטאָסיס אָבער קיין ווייַטער פאַרגרעסערן אין צעל פאָרעם ענדערונגען (CCR = 3.60) קאַמפּערד מיט אַנטריטיד קד (CCR = 3.46, ns) אָדער וואָרטמאַנין-באהאנדלט קאָנטראָל סעלז (3.61).ns = טוט נישט ענין.+/- SEM מעזשערמאַנץ פֿאַר 50 סעלז זענען געוויזן.סטאַטיסטיש דיפעראַנסיז זענען קאַלקיאַלייטיד ניצן תּלמיד ס ה-פּרובירן.
(א) סכעמאַטיש פאַרטרעטונג פון ינאַבישאַן און אַקטאַוויישאַן פון די PI3K-AKT פּאַטוויי ריזאַלטינג אין AJ ענדערונגען און ראַטעווען ריספּעקטיוולי.(ב) פּראָפּאָסעד מאָדעל פֿאַר AKT פּראָטעין סטייבאַלאַזיישאַן דורך SPECC1L.
פּרעמיגראַטאָרי CNCCs דאַרפן AJ ליסיס צו באַזונדער פון אַנטיריער נעוראַל פאַרלייגן נעוראָעפּיטהעליאַל סעלז 1,15,32.געוואקסן סטיינינג פון AJ קאַמפּאָונאַנץ און אָנווער פון די אַפּיקאַל-בייסאַל AJ אַסיממעטריק פאַרשפּרייטונג אין SPECC1L-דיפישאַנט סעלז ביידע אין וויטראָ און אין וויוואָו, קאַמביינד מיט די גשמיות פּראַקסימאַטי פון SPECC1L צו β-קאַטענין, פֿאָרשלאָגן אַז SPECC1L פאַנגקשאַנז צו רעכט טייַנען AJ היגע פעסטקייַט פֿאַר אָרגאַניזאַציע מאַסאַלז.אַקטין סיטאָסקעלעט.דער פאַרבאַנד פון SPECC1L מיט די אַקטין סיטאָסקעלעטאָן און β-קאַטענין און די פאַרגרעסערן אין די נומער פון קאַנדענסט אַקטין פילאַמאַנץ אין דער אַוועק פון SPECC1L איז קאָנסיסטענט מיט די באמערקט פאַרגרעסערן אין AJ געדיכטקייַט.אן אנדער מעגלעכקייט איז אַז אַ געוואקסן נומער פון אַקטין פייבערז אין SPECC1L-דיפישאַנט סעלז פירן צו אַ ענדערונג אין ינטערסעללולאַר שפּאַנונג.ווייַל סעליאַלער דרוק אַפעקץ אַדזש 33 דינאַמיק, וואָולטידזש ענדערונגען קענען רעזולטאַט אין מער דיפיוז אַדזש 34.אַזוי קיין ענדערונגען וועט ווירקן די CNCC לייַערס.
Wnt1 איז אויסגעדריקט אין די פרי נעוראַל פאָולדז וואָס פירן צו נעוראַל קאַם סעלז.אזוי, Wnt1-cre ייכעס טרייסינג מאַרקס ביידע פאַר- און מייגרייטינג NCC35.אָבער, Wnt1 אויך מאַרקס דאָרסאַל מאַרך געוועב קלאָונז אויך דערייווד פון פרי נעוראַל פאָולדז 35,36, מאכן עס מסתּמא אַז אונדזער סטיינינג פון E9.5 מיוטאַנץ פֿאַר Wnt1 מאַרקערס אין עפענען נעוראַל פאָולדז איז נישט CNCC.אונדזער positive סטיינינג פֿאַר די NCC מאַרקערס AP2A און SOX10 באשטעטיקט אַז די יקספּאָוזד נעוראַל פאָולדז פון Specc11 מוטאַנט עמבריאָוז האָבן טאַקע אַנטהאַלטן CNCC.אין אַדישאַן, זינט AP2A און SOX10 זענען מאַרקערס פון פרי מייגרייטינג NCC, positive סטיינינג אנגעוויזן אַז די סעלז זענען נאָך מיגראַטאָרי CNCC וואָס קענען ניט זיין סטראַטאַפייד דורך E9.5.
אונדזער דאַטן פֿאָרשלאָגן אַז מאָלעקולאַר רעגולירן פון AJ דורך SPECC1L איז מידיייטיד דורך PI3K-AKT סיגנאַלינג.AKT סיגנאַלינג איז רידוסט אין SPECC1L דיפישאַנט סעלז און געוועבן.פיינדינגז דורך Fantauzzo עט על.שטיצן אַ דירעקט ראָלע פֿאַר PI3K-AKT סיגנאַלינג אין קראַניאָפאַסיאַל מאָרפאָגענעסיס.(2014) געוויזן אַז די פעלן פון אַקטאַוויישאַן פון PDGFRα-באזירט PI3K-AKT סיגנאַלינג פירט צו אַ שפּאַלטן גומע פענאָטיפּע.מיר אויך ווייַזן אַז ינאַבישאַן פון די PI3K-AKT פּאַטוויי איז גענוג צו טוישן AJ און צעל פאָרעם אין U2OS סעלז.קאָנסיסטענט מיט אונדזער פיינדינגז, Cain et al.37 געוויזן אַז דאַונרעגולאַטיאָן פון די PI3K α110 סובוניט אין ענדאָושעליאַל סעלז רעזולטאטן אין אַ ענלעך פאַרגרעסערן אין פּעריסעללולאַר β-קאַטענין סטיינינג, ריפערד צו ווי אַ פאַרגרעסערן אין די "קאַנעקטיוויטי אינדעקס".אָבער, אין ענדאָושעליאַל סעלז וועמענס אַקטין פילאַמאַנץ זענען שוין העכסט אָרגאַניזירט, סאַפּרעשאַן פון די PI3K-AKT פּאַטוויי רעזולטאַטן אין אַ פרייַ צעל פאָרעם.אין קאַנטראַסט, SPECC1L-kd U2OS סעלז געוויזן אַן ילאָנגגייטאַד צעל פאָרעם.דער חילוק קען זיין צעל טיפּ ספּעציפיש.בשעת סאַפּרעשאַן פון PI3K-AKT סיגנאַלינג פּערמאַנאַנטלי אַפעקץ די אַקטין סיטאָסקעלעטאָן, די ווירקונג אויף צעל פאָרעם איז באשלאסן דורך ענדערונגען אין שפּאַנונג געפֿירט דורך ענדערונגען אין די געדיכטקייַט און אָרגאַניזאַציע פון ​​הויפט אַקטין פייבערז.אין U2OS סעלז, מיר געוויינט בלויז צעל פאָרעם ענדערונגען ווי אַ מאַרקער פון SPECC1L-דיפישאַנט AJ טוישן און אָפּזוך.אין מסקנא, מיר כייפּאַטייזיז אַז ינאַבישאַן פון די AKT פּאַטוויי אין SPECC1L דיפישאַנסי ינקריסאַז AJ פעסטקייַט און ראַדוסאַז דעלאַמינאַטיאָן אין CNCC.
ינטערעסטינגלי, פּאַנ-AKT לעוועלס זענען רידוסט אין וויטראָ און אין וויוואָו אין אַדישאַן צו פאָספאָרילאַטעד 473-AKT לעוועלס אין דער אַוועק פון SPECC1L, סאַגדזשעסטינג רעגולירן פון PI3K-AKT סיגנאַלינג אין דער מדרגה פון AKT פּראָטעין פעסטקייַט אָדער ויסקער.די SPECC1L און MID1 גענעס, ביידע פֿאַרבונדן מיט Opitz / GBBB סינדראָום, ענקאָוד פּראָטעינס וואָס סטייבאַלייז מיקראָטובולעס 18,22.די מעקאַניזאַם דורך וואָס SPECC1L און MID1 מידיייט מיקראָטובולע ​​סטייבאַלאַזיישאַן איז נישט גאָר פארשטאנען.אין דעם פאַל פון SPECC1L, דעם סטייבאַלאַזיישאַן כולל ענכאַנסט אַסעטילאַטיאָן פון אַ סאַבסעט פון מיקראָטובולעס 18.עס איז מעגלעך אַז SPECC1L ניצט אַ ענלעך מעקאַניזאַם צו סטייבאַלייז אנדערע פּראָטעינס אַזאַ ווי AKT.עס איז געוויזן אַז אַסעטילאַטיאָן פון ליסין רעזאַדוז אין די AKT פּראָטעין פירט צו אַ פאַרקלענערן אין מעמבראַנע לאָוקאַלאַזיישאַן און פאָספאָרילאַטיאָן38.אין אַדישאַן, די Ubiquitination פון די K63 קייט אין דער זעלביקער ליסין רעזאַדו אויף AKT איז פארלאנגט פֿאַר זייַן מעמבראַנע לאָוקאַלאַזיישאַן און אַקטאַוויישאַן 39,40.צווישן עטלעכע סיבות ינטעראַקטינג מיט SPECC1L פּראָטעינס יידענאַפייד אין פאַרשידן הויך טרופּוט הייוון צוויי-כייבריד סקרינז, פיר - CCDC841, ECM2942, APC און UBE2I43 - האָבן שוין ימפּלאַקייטיד אין פּראָטעין ויסקער אָדער פעסטקייַט דורך וביקוויטינאַטיאָן אָדער סומוילאַטיאָן.SPECC1L קען זיין ינוואַלווד אין פּאָסט-טראַנסליישאַנאַל מאָדיפיקאַטיאָן פון AKT ליסינע רעזאַדוז, אַפעקטינג AKT פעסטקייַט.אָבער, די קריטיש ראָלע פון ​​SPECC1L אין די לאָוקאַלאַזיישאַן און פעסטקייַט פון די AKT פּראָטעין איז נאָך צו זיין ילוסידאַד.
שטרענג חסרונות אין SPECC1L אויסדרוק אין וויוואָו ריזאַלטיד אין געוואקסן סטיינינג פון AJ מאַרקער און דעפעקטיווע CNCC אָוווערליי, ווי געזונט ווי געוואקסן אַפּאָפּטאָסיס און פרי עמבריאָניק לעטאַלאַטי.פריער ריפּאָרץ האָבן געוויזן אַז מויז מיוטאַנץ מיט געוואקסן לעוועלס פון אַפּאָפּטאָסיס זענען פארבונדן מיט נעוראַל רער חסרונות 44,45,46,47 און קראַניאָפאַסיאַל חסרונות48.עס איז געווען סאַגדזשעסטיד אַז יבעריק צעל טויט אין די נעוראַל פאָולדז אָדער פאַרינגעאַל אַרטשעס קען רעזולטאַט אין אַ ניט גענוגיק נומער פון סעלז פארלאנגט פֿאַר געהעריק מאָרפאָגענעטיק באַוועגונג 48,49,50.אין קאַנטראַסט, אונדזער SPECC1L דיפישאַנט צעל שורות מיט מאַדעראַטלי רידוסט SPECC1L אויסדרוק געוויזן בלויז AJ ענדערונגען אָן זאָגן פון געוואקסן צעל טויט.אָבער, כעמישער ינאַבישאַן פון די PI3K-AKT פּאַטוויי אין די Kd סעלז האט געפֿירט צו געוואקסן אַפּאָפּטאָסיס.אזוי, אַ מעסיק פאַרקלענערן אין SPECC1L אויסדרוק אָדער פונקציע ינשורז צעל ניצל.דאָס איז קאָנסיסטענט מיט די אָבסערוואַציע אַז זעלטן Specc11 מוטאַנט עמבריאָוז וואָס אַנטלויפן אַרעסט אין סט.E9.5 - טאָמער רעכט צו רידוסט דזשין כאַפּן עפעקטיווקייַט - זענען ביכולת צו פאַרמאַכן זייער נעוראַל טובז און האַלטן שפּעטער אין אַנטוויקלונג, אָפט מיט קראַניאָפאַסיאַל חסרונות (Fig. S3).אויך קאָנסיסטענט מיט דעם איז די זעלטן פּאַסירונג פון העטעראָזיגאָוס ספּעקק1ל עמבריאָוז מיט קראַניאָפאַסיאַל אַבנאָרמאַלאַטיז - מיסטאָמע רעכט צו געוואקסן דזשין כאַפּן עפעקטיווקייַט - ווי געזונט ווי דער דערגייונג אין זעבראַפיש אין וואָס איינער פון די צוויי SPECC1L אָרטאַלאַדזשיז (ספּעק1לב) ז שפּעט עמבריאָניק פענאָטיפּעס, אַרייַנגערעכנט אָנווער פון נידעריקער דזשאָז און ביילאַטעראַל קלעפץ51.אזוי, העטעראָזיגאָוס SPECC1L מיוטיישאַנז יידענאַפייד אין מענטש פּאַטיענץ קען פאַרשאַפן קליין ימפּערמאַנץ אין SPECC1L פונקציע בעשאַס קראַניאָפאַסיאַל מאָרפאָגענעסיס, גענוג צו דערקלערן זייער אָראָפאַסיאַל קלעפץ.SPECC1L-באזירט רעגולירן פון ינטערסעללולאַר קאָנטאַקטן קען אויך שפּילן אַ ראָלע אין פּאַלאַטאָגענעסיס און פוסיאָן פון די פאַרינגעאַל אַרטשעס.ווייַטער שטודיום פון SPECC1L פונקציאָנירן וועט העלפֿן דערקלערן די ראָלע פון ​​​​צייַטווייַליק ינטערסעללולאַר קאָנטאַקטן אין CNCC בעשאַס נעוראַל רער קלאָוזשער אין נעוראָעפּיטהעליאַל צעל מאָוטיליטי און קראַניאָפאַסיאַל מאָרפאָגענעסיס.
U2OS אָסטעאָסאַרקאָמאַ קאָנטראָל און SPECC1L-kd סעלז האָבן שוין דיסקרייבד פריער (Saadi et al., 2011).אַנטיבאָדיעס קעגן SPECC1L זענען אויך קעראַקטערייזד פריער (Saadi et al., 2011).אַנטי-β-קאַטענין אַנטיבאָדיעס (קיניגל; 1:1000; סאַנטאַ קרוז, Dallas, טקסס) (מויז; 1:1000; צעל סיגנאַלינג טעכנאָלאָגיע, דאַנווערס, מאַ), מיאָסין IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, קאָלאָ.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, סאַן דיעגאָ , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) ), KI67 (1:1000; צעל סיגנאַלינג טעכנאָלאָגיע, דאַנווערס, מאַ), קלעאַוועד קאַספּאַסע 3 (1:1000; צעל סיגנאַלינג טעכנאָלאָגיע, דאַנווערס, מאַ) און β-אַקטין (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) איז געניצט ווי דיסקרייבד..אַקטין פילאַמאַנץ זענען סטיינד מיט אַקטי-פלעק רהאָדאַמינע פאַללאָידין (סיטאָסקעלעטאָן, דענווער, קאָלאָראַדאָ).
U2OS קאָנטראָל סעלז און SPECC1L-kd סעלז זענען קאַלטשערד אין נאָרמאַל הויך גלוקאָוס DMEM סאַפּלאַמענטאַד מיט 10% פיטאַל באָווין סערום (Life Technologies, Carlsbad, CA).פֿאַר AJ ענדערונגען, 2 X 105 סעלז זענען סידעד אויף גלאז באהאנדלט מיט 0.1% כאַזער דזשעלאַטאַן (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) און באמערקט פֿאַר ענדערונגען אין צעל פאָרעם.סעלז זענען געזאמלט אין פאַרשידענע ינדאַקייטיד צייט פונקטן: 4 שעה נאָך סעדינג (ה = 1), 24 שעה נאָך סעדינג (ה = 2), קאַנפלואַנס אָן טוישן אין צעל פאָרעם (ה = 3), טוישן אין צעל פאָרעם (ה = 4) , 24 ה נאָך צעל פאָרעם טוישן (ה = 5) און 48 ה נאָך צעל פאָרעם טוישן (ה = 6) (Fig. 1, 2, 3).צו מאָדולירן די PI3K-AKT פּאַטוויי, סעלז זענען קאַלטשערד אין די אנגעוויזן קאַנסאַנטריישאַנז מיט די PI3K-AKT ינכיבאַטער וואָרטמאַנין (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) אָדער SC-79 אַקטיוואַטאָר (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).די מיטל מיט די קעמיקאַלז איז טשיינדזשד טעגלעך.
ראַם-דורך-ראַם רעקאָרדינגס זענען געמאכט אויף לעבן קאָנטראָל און KD סעלז אונטער נאָרמאַל קולטור טנאָים, און פאַסע קאַנטראַסט בילדער זענען געזאמלט יעדער 10 מינוט פֿאַר 7 טעג.בילדער זענען קונה מיט אַ קאָמפּיוטער-קאַנטראָולד Leica DM IRB ינווערטיד מיקראָסקאָפּ יקוויפּט מיט אַ מעטשאַניקאַל בינע און אַ 10 × N-PLAN אָביעקטיוו פארבונדן צו אַ QImaging Retiga-SRV אַפּאַראַט.בעשאַס ימידזשינג, צעל קאַלטשערז זענען מיינטיינד בייַ 37 ° C אין אַ פייַכט אַטמאָספער מיט 5% CO2.
צוויי דזשין טראַפּ עס צעל שורות DTM096 און RRH048 פֿון די רעגיאָנאַל מוטאַנט מאַוס ריסאָרס צענטער (UC Davis, CA) זענען געניצט צו דזשענערייט ספּעקק11 דיפישאַנט מויז שורות, דעזיגנייטיד Specc1lgtDTM096 און Specc1lgtRRH046.בעקיצער, 129 / REJ ES סעלז זענען ינדזשעקטיד אין C57BL6 בלאַסטאָסיס.די ריזאַלטינג טשימעריק זכר מיסע זענען ברעד מיט ווייַבלעך C57BL6 מיסע צו ידענטיפיצירן זאמען מיט אַגאָוטי מאַנטל קאָליר.די בייַזייַן פון דזשין טראַפּ וועקטאָר ינסערץ איז געניצט צו ידענטיפיצירן העטעראָזיגאָטעס.מיסע זענען געהאלטן אויף אַ געמישט הינטערגרונט פון 129 / REJ; C57BL6.דער אָרט פון די ינסערשאַן פּלאַץ פון די גענעטיק טראַפּ וועקטאָר איז באשטעטיקט דורך RT-PCR, גענאָמע סיקוואַנסינג און גענעטיק קאַמפּלאַמענטיישאַן (סופּפּלעמענטאַרי פיגור 1).צו שפּור די CNCC ייכעס פון טאָפּל העטעראָזיגאָוס ספּעקק1לגט מיסע, ROSAmTmG (#007576) און Wnt1-Cre (#003829) מיסע (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) זענען קראָסט צו פּראָדוצירן די ROSAMTmG און Wnt1-Cre אַלעל אין ספּעק 1.אַלע יקספּעראַמאַנץ אין מיסע זענען דורכגעקאָכט לויט פּראָטאָקאָלס באוויליקט דורך די ינסטיטושאַנאַל אַנימאַל קער און נוצן קאַמיטי פון די אוניווערסיטעט פון קאַנסאַס מעדיקאַל צענטער.
עמבריאָוז זענען פאַרפעסטיקט אין (1% פאָרמאַלדאַכייד, 0.2% גלוטאַראַלדעהידע, 2 מם מגקל 2, 0.02% נפּ-40, 5 מם עגטאַ) פֿאַר 60 מינוט אין צימער טעמפּעראַטור.נאָך פיקסיישאַן אין רענטגענ-גאַל סטיינינג לייזונג (5 מם פּאַטאַסיאַם פעריסיאַנידע, 5 מם פּאַטאַסיאַם פערראָסיאַנייד, 2 מם מגקל2, 0.01% סאָדיום דעאָקסיטשאָלאַטע, 0.02% נפּ-40, 1 מג / מל X-גאַל) פלעק אַנטוויקלונג איז געווען דורכגעקאָכט ביי 37 ° C .°C ין 1-6 שעה.עמבריאָוז זענען פּאָסט-פיקסט אין 4% PFA און וויזשוואַלייזד.
פֿאַר מערב בלאָטינג, סעלז זענען ליסעד אין פּאַסיוו ליסיס באַפער (פּראָמעגאַ, פיטשבורג, ווי) סאַפּלאַמענטאַד מיט אַ געמיש פון HALT פּראָטעאַסע ינכיבאַטערז (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).ליסאַטעס זענען פּראַסעסט אויף 12% פּאָליאַקרילאַמידע מיני-פּראָטעאַן טגקס פאַרטיק דזשעלז (Bio-Rad, Hercules, CA) און טראַנספערד צו Immobilon PVDF מעמבריינז (EMD Millipore, Billerica, MA).די מעמבריינז זענען אפגעשטעלט אין 5% מילך אין פּבס מיט 0.1% טוועען.אַנטיבאָדיעס זענען ינגקיובייטיד יבערנאַכטיק בייַ 4 ° C אָדער פֿאַר איין שעה אין צימער טעמפּעראַטור.Femto SuperSignal West ECL רייידזשאַנט (Thermo Scientific, Waltham, MA) איז געניצט פֿאַר סיגנאַל דור.פֿאַר ימיונאַסטיינינג, עמבריאָוז זענען פאַרפעסטיקט יבערנאַכטיק אין 4% PFA / PBS און קריאָפּערוועד.געוועב קריאָסעקטיאָנס זענען אפגעשטעלט אין פּבס מיט 1% נאָרמאַל ציגעלע סערום (טהערמאָ ססיענטיפיק, וואַלטהאַם, מאַ) און 0.1% טריטאָן X-100 (סיגמאַ-אַלדריטש, סט. לאָויס, מאָ) און דעמאָלט ינקובייטיד ביי 4 ° C אין אַ ינגקיאַבייטער בעשאַס די ינגקיובייט. נאַכט.מיט אַנטי-אַנטיבאָדי און פלורעסאַנט צווייטיק אַנטיבאָדי (1:1000) פֿאַר 1 שעה בייַ 4 °C.סטיינד סעקשאַנז זענען געשטעלט אין פּראָלאָנג גאָלד מיטל (טהערמאָ ססיענטיפיק, וואַלטהאַם מאַ) און פלאַך בילדער זענען באקומען מיט אַ Leica TCS SPE קאָנפאָקאַל מיקראָסקאָפּ.יעדער ימיונאַסטיינינג איז געווען דורכגעקאָכט ווי דריי פרייַ יקספּעראַמאַנץ אויף סיראָססעקשאַנז פון בייַ מינדסטער צוויי מיוטאַנט עמבריאָוז.א רעפּריזענאַטיוו עקספּערימענט איז געוויזן.
סעלז זענען ינקובייטיד אין מאַדאַפייד ריפּאַ באַפער (20 מם טריס-הקל, ף 8.0, 1% נפּ-40, 130 מם נאַקל, 10% גליסעראָל, 2 מם עדטאַ, און HALT פּראָטעאַסע ינכיבאַטער (סיגמאַ-אַלדריטש, סט. לאָויס, מאָ) בעקיצער, ליסאַטעס זענען פּריפּיוראַפייד מיט פּראָטעין ג מאַגנעטיק קרעלן (לעבן טעטשנאָלאָגיעס, קאַרלסבאַד, CA) און דעמאָלט ינקובייטיד יבערנאַכטיק ביי 4 ° סי מיט אַנטי-SPECC1L אָדער IgG פּראָטעין ג פּראָטעין קרעלן זענען געניצט צו עקסטראַקט ספּעקק1ל און מערב בלאָטינג איז דורכגעקאָכט מיט די אַנטי-ספּעקק1ל. -β-קאַטענין אַנטיבאָדי דיסקרייבד אויבן די קאָ-IP יקספּעראַמאַנץ געוויזן זענען רעפּריזענאַטיוו פון פיר פרייַ יקספּעראַמאַנץ.
פאַרפעסטיקט קאַלטשערד סעלז אָדער מויז עמבריאָניק געוועבן זענען צוגעשטעלט צו די עלעקטראָן מיקראָסקאָפּי צענטער אין די אוניווערסיטעט פון קאַנסאַס מעדיקאַל צענטער.בעקיצער, סאַמפּאַלז זענען עמבעדיד אין עמבעד 812 סמאָלע (עלעקטראָן מיקראָסקאָפּי ססיענסעס, פאָרט וואַשינגטאָן, פּאַ), פּאַלימערייזד יבערנאַכטיק ביי 60 ° C, און סעקשאַנד ביי 80 נם מיט אַ Leica UC7 ולטראַמיקראָטאָמע יקוויפּט מיט אַ דימענט בלייד.סעקשאַנז זענען וויזשוואַלייזד מיט אַ JEOL JEM-1400 טראַנסמיסיע עלעקטראָן מיקראָסקאָפּ יקוויפּט מיט אַ 100 קוו לאַב 6 ביקס.
ווי צו ציטירן דעם אַרטיקל: Wilson, NR et al.דיפישאַנסי פון SPECC1L פירט צו געוואקסן פעסטקייַט פון ספּלייסט דזשוינץ און רידוסט דעלאַמינאַטיאָן פון קראַניאַל נעוראַל קאַם סעלז.די וויסנשאַפֿט.6 , 17735 ;דאָי: 10.1038/סרעפּ17735 (2016).
סיינט-דזשין, דזש-פּ.ינדאַקשאַן און דיפערענשייישאַן פון די נעוראַל קאַם.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
קאָרדעראָ, דר עט על.קראַניאַל נעוראַל קאַם סעלז אין באַוועגונג: זייער ראָלע אין קראַניאָפאַסיאַל אַנטוויקלונג.אמעריקאנער זשורנאַל פון מעדיציניש גענעטיק.טייל א 155אַ, 270–279, דאָי: 10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP נעוראָקריסטאָפּאַטהיאַ: זייַן וווּקס און אַנטוויקלונג איבער 20 יאָר.פּידיאַטרישאַן.פּאַטאַלאַדזשי.לאַבאָראַטאָריע.מעדיצין.17, 1-25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU און Noten MM ברייקטרו אין די דזשאַנעטיקס פון אָראָפאַסיאַל קלעפץ.טרענדס אין מאָלעקולאַר מעדיסינע 17, 725-733, דאָי: 10.1016/דזש.מאָלמעד.2011.07.007 (2011).
Minu, M. און Riley, FM מאָלעקולאַר מעקאַניזאַמז פון קראַניאַל נעוראַל קאַם צעל מייגריישאַן און מוסטערונג בעשאַס קראַניאָפאַסיאַל אַנטוויקלונג.אנטוויקלונג 137, 2605-2621, דאָי: 10.1242 / דעוו.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH און Murray, JK קלעפט ליפּ און גומען: פארשטאנד גענעטיק און ינווייראַנמענאַל ינפלואַנסיז.נאַטירלעך קאָמענטאַר.גענעטיקס 12, 167-178, דאָי: 10.1038 / nrg2933 (2011).
ינגראַם, CR עט על.אַבנאָרמאַל מאָרפאָגענעסיס פון די הויט, לימז און קראַניאָפאַסיאַל געגנט אין ינטערפעראָן-רעגיאַלייטינג פאַקטאָר-6 (ירפ6)-דיפישאַנט מיסע.נאַציאָנאַלער גענעט.38, 1335-1340, דאָי: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. עט על.דאָמינאַנט מיוטיישאַנז אין GRHL3 גרונט Van der Waord סינדראָום און ימפּרוווינג אַנטוויקלונג פון די מויל פּערידערם.Am J Hum Genet 94, 23-32, דאָי: 10.1016/דזש.אַדזשהג.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ און Juriloff, DM דערהייַנטיקן די רשימה פון מויז מיוטאַנץ מיט חסרונות אין נעוראַל רער קלאָוזשער און פּראָגרעס צו אַ גאַנץ גענעטיק פארשטאנד פון נעוראַל רער קלאָוזשער.ויספאָרשונג פון געבורט חסרונות.טייל א, קליניש און מאָלעקולאַר טעראַטאָלאָגי 88, 653-669, דאָי: 10.1002/בדראַ.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-מעדיאַטעד PDGFRalpha סיגנאַלינג רעגיאַלייץ ניצל און פּראָוליפעריישאַן אין סקעלעטאַל אַנטוויקלונג דורך אַ פּ53-אָפענגיק ינטראַסעללולאַר פּאַטוויי.גענע דעוועלאָפּמענט 28, 1005-1017, דאָי: 10.1101/גאַד.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND און Murdoch, JN דישעוועלעד: שייכות פון קאַנווערדזשאַנט יקספּאַנשאַן צו נעוראַל רער קלאָוזשער.טרענדס אין נוראַלאַדזשי.26, 453-455, דאָי: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).