347 ומבאַפלעקט שטאָל קוילד טובינג כעמישער קאָמפּאָנענט, לעגיטימאַציע פון ​​​​ראָמאַן ינטערפעראָן-אָפּרופיק מענטש לעוקאָסיטע אַנטיגען-א (HLA-A) טשאַפּעראָנע פּראָטעינס מיט קראָס-לינגקט מאַסע ספּעקטראָמעטרי (קלמס)

דאנק איר פֿאַר באזוכן Nature.com.איר נוצן אַ בלעטערער ווערסיע מיט לימיטעד CSS שטיצן.פֿאַר דער בעסטער דערפאַרונג, מיר רעקאָמענדירן אַז איר נוצן אַ דערהייַנטיקט בלעטערער (אָדער דיסייבאַל קאַמפּאַטאַבילאַטי מאָדע אין Internet Explorer).אין אַדישאַן, צו ענשור אָנגאָינג שטיצן, מיר ווייַזן דעם פּלאַץ אָן סטיילז און דזשאַוואַסקריפּט.
סלידערס וואָס ווייַזן דריי אַרטיקלען פּער רוק.ניצן די צוריק און ווייַטער קנעפּלעך צו מאַך דורך די סליידז, אָדער די רוק קאָנטראָללער קנעפּלעך אין די סוף צו מאַך דורך יעדער רוק.

פּראָדוקט באַשרייַבונג

ומבאַפלעקט שטאָל 347 ל שפּול טובז, שטאָל מיינונג: SS347L

די ינטערפעראָן סיגנאַלינג סיסטעם ינדוסיז אַ שטאַרק סיטאָקינע ענטפער צו אַ ברייט קייט פון פּאַטאַדזשעניק און ינטרינסיק פּאַטאַלאַדזשיקאַל סיגנאַלז פון דער סביבה, ריזאַלטינג אין די ינדאַקשאַן פון סאַבסעץ פון ינטערפעראָן-ינדוסאַבאַל פּראָטעינס.מיר האָבן געווענדט DSS-מעדיאַטעד קרייַז-לינק מאַסע ספּעקטראָמעטרי (CLMS) צו דעטעקט נייַע פּראָטעין-פּראָטעין ינטעראַקשאַנז אין די פעלד פון ינטערפעראָן-ינדוסט פּראָטעינס.אין אַדישאַן צו די דערוואַרט ינטערפעראָן-ינדוסאַבאַל פּראָטעינס, מיר אויך יידענאַפייד ראָמאַן ינטערמאָלעקולאַר און ינטראַמאָלעקולאַר קראָס-לינגקט אַדדוקץ פון קאַנאָניקאַל ינטערפעראָן-ינדוסאַבאַל פּראָטעינס אַזאַ ווי MX1, USP18, OAS3 און STAT1.מיר פאָוקיסט אויף אָרטאָגאָנאַל וואַלאַדיישאַן פון אַ ראָמאַן גאַנג פון ינטערפעראָן-ינדוסאַבאַל פּראָטעין נעטוואָרקס געשאפן דורך HLA-A פּראָטעינס (H2BFS-HLA-A-HMGA1) ניצן קאָ-יממונאָפּרעסיפּיטאַטיאָן און זייער ווייַטער לערנען ניצן מאָלעקולאַר דינאַמיק מאָדעלינג.מאָדעלינג פון די קאַנפאָרמיישאַן דינאַמיק פון די פּראָטעין קאָמפּלעקס אנטפלעקט עטלעכע ינטעראַקשאַן זייטלעך וואָס שפיגלט די ינטעראַקשאַנז יידענאַפייד אין די CLMS פיינדינגז.צוזאַמען, מיר פאָרשטעלן אַ פּילאָט לערנען פון CLMS צו ידענטיפיצירן נייַ סיגנאַלינג קאַמפּלעקסאַז ינדוסט דורך ינטערפעראָן, און קוק פאָרויס צו די ברייט נוצן פון CLMS צו ידענטיפיצירן נייַע דינאַמיק פון פּראָטעין ינטעראַקשאַנז אין די אָנוווקס מיקראָענוויראָנמענט.
איידער אַ אַדאַפּטיוו ימיון ענטפער הייבט, דער באַלעבאָס ס ינייט פאַרטיידיקונג סיסטעם מאַונץ אַן אַנטימיקראָביאַל ענטפער מידיייטיד דורך אַ משפּחה פון סעקרעטעד אַלף-העליקאַל סיטאָקינעס גערופן ינטערפעראָנס (IFNs).די טיפּ I IFN קלאסן IFNα און IFNβ אַקטאַווייט סעליאַלער רעספּאָנסעס, אַרייַנגערעכנט אַנטיוויראַל, פּראָאַפּאָפּטאָטיק, פּראָ-ינפלאַמאַטאָרי און אַנטיפּראָליפעראַטיווע שטאַטן.אין יומאַנז, 13 סובטיפּעס פון IFNα זענען באקאנט, אַלע קלאַסטערד אויף כראָמאָסאָם 91. סאַפּרייזינגלי, בלויז IFNα2 איז געלערנט פֿאַר קליניש נוצן.לעצטנס, ספּעציעל ופמערקזאַמקייט איז באַצאָלט צו פאָרשונג אויף אנדערע סובטיפּעס פון IFNα.א פריש לערנען געוויזן אַז IFNα14 איז איינער פון די מערסט עפעקטיוו יסאָפאָרמס אין ריסטריקטינג HBV2 און HIV-13,4 רעפּלאַקיישאַן קאַמפּערד מיט די קאַנאַנאַקאַל IFNα2 סובטיפּע.
עס איז געגרינדעט אַז אַקטיווייטיד טיפּ I ינטערפעראָן רעסעפּטאָר קאַמפּלעקסאַז (IFNAR1 און IFNAR2) צינגל אַ סיגנאַל טראַנסדוקטיאָן קאַסקייד מידיייטיד דורך Janus kinases TYK2 און JAK15,6.די דזשאַנוס קינאַסעס פאָספאָרילאַטע סיגנאַל טראַנסדוסער און טראַנסקריפּטיאָנאַל פּראָטעין אַקטיוואַטאָרס (STAT1 און STAT2) אויף טיראָסינע רעזאַדוז צו אָנהייבן SH2 פעלד-מעדיאַטעד העטעראָדימעריזאַטיאָן6.דערנאָך, IRF9 ביינדז STAT העטעראָדימערס צו פאָרעם אַ טרימעריק קאָמפּלעקס פון די IFN-סטימיאַלייטיד פאַקטאָר 3 דזשין (ISGF3), וואָס טראַנסלאָקאַטעס צו די קערן און ינדוסיז די טראַנסקריפּציע פון ​​איבער 2000 ינטערפעראָן-סטימיאַלייטיד גענעס (ISGs) 5,6,7,8.
יסגס פאָרעם די באַקבאָון פון די ינייט ימיון סיסטעם, ספּעציעל אין ענטפער צו וויראַל באַפאַלן.ווי אַ ערשטער שורה פון פאַרטיידיקונג קעגן וויראַל ינפעקציע, סעלז ראַפּאַדלי צעוויקלען ברייט ינטעראַקשאַנז פון סעליאַלער פּראָטעינס מיט אַ ברייט קייט פון בייאַלאַדזשיקאַל אַקטיוויטעטן.די פּראָטעינס אַרייַננעמען מוסטער דערקענונג ראַסעפּטערז, סיגנאַלינג מאַלאַקיולז, טראַנסקריפּציע סיבות און פּראָטעינס מיט דירעקט אַנטיוויראַל פאַנגקשאַנז, ווי געזונט ווי נעגאַטיוו רעגיאַלייטערז פון ימיון רעספּאָנסעס9.פיל פון די אינפֿאָרמאַציע וועגן ISG טעטיקייט קומט פון פאַנגקשאַנאַל סקרינז ניצן אָוווערעקספּרעססיאָן סקרינז 10,11 אָדער דזשין סילענסינג טעקניקס (sirna, RNAi און CRISPR) 12,13 אין וואָס יחיד יסגס זענען אויסגעדריקט אָדער ינכיבאַטיד און זייער טעטיקייט איז טעסטעד אויף פאַרשידן ווירוסעס.כאָטש די שטודיום האָבן באשלאסן די אַנטיוויראַל פּראָפּערטיעס פון יחיד ISGs, די אַנדערלייינג מאָלעקולאַר מעקאַניזאַמז פון יעדער ISG בלייבן לאַרגעלי אומבאַקאַנט.עס איז בכלל אנגענומען אַז פילע פּראָטעינס ינטעראַקט מיט איין אָדער מער סיטאָקינעס צו ענשור פול טעטיקייט, אַזוי אָדער ISGs ינטעראַקט גלייַך אָדער זייער ינטעראַקשאַנז זענען מידיייטיד דורך סעליאַלער פּראָטעינס.פֿאַר בייַשפּיל, אַ פריש פאָטאָקראָססלינגקעד פּראָטעאָמיקס לערנען יידענאַפייד ATPase VCP / p97 ווי אַ הויפּט IFITM3 ינטעראַקשאַן שוטעף, וועמענס ינאַבישאַן פירט צו חסרונות אין ליסאָסאָמאַל סאָרטינג, ויסקער און קאָטראַנספּאָרט פון IFITM3 מיט וויראַל פּאַרטיקאַלז 14 .מיט ימיונאָפּרעסיפּיטאַטיאָן, מיר יידענאַפייד VAPA, אַ וועסיקלע-פארבונדן פּראָטעין, ווי אַ ינטעראַקשאַן שוטעף מיט IFITM1/2/3 וואָס מידיייץ קאַלעסטעראַל-מעדיאַטעד וויראַל מאַטשוריישאַן, און דאָס איז באשטעטיקט דורך אן אנדער לערנען מיט אַ הייוון צוויי-כייבריד סיסטעם.וויסנשאפטלעכע שטיצע 15 , 16 .
א פונדאַמענטאַל בייאַלאַדזשיקאַל פּראָצעס ינוואַלווד אין די סאַפּרעשאַן פון ינפעקציע און מאַליגנאַנט טראַנספאָרמאַציע איז אַנטיגען פּרעזענטירונג, וואָס איז מידיייטיד דורך הויפּט כיסטאָוקאַמפּאַטאַבילאַטי קאָמפּלעקס (MHC) מאַלאַקיולז.פּעפּטיידז (8-12 אַמינאָ אַסאַדז לאַנג) פון קלעאַוועד, פּרימאַטשורלי טערמאַנייטיד אָדער מיספאָלדעד פּראָטעינס זענען לאָודיד אין די MHC-I העטעראָדימער (באשטייט פון MHC-I שווער און ליכט קייטן, גערופן β-2-מיקראָגלאָבולין; β2M) 17,18.די ריזאַלטינג סטאַביל MHC-I טרימערז זענען טראַנספּאָרטאַד צו די צעל ייבערפלאַך, ווו זיי פאָרשטעלן ינטראַסעללולאַר פּעפּטיידז צו CD8+ ט סעלז (סיטאָטאָקסיק ט סעלז)17.ט סעלז דערקענען און צעשטערן די פּאַטאַדזשאַנז און סעלז וואָס פירן אַ אָנוווקס-ספּעציפיש אַנטיגען.דעריבער, פּאַטאַדזשאַנז און אָנוווקס סעלז אָפט פאַרשטיקן די אַנטיגען פּרעזענטירונג פּראָצעס צו ויסמיידן ימיון סערוויילאַנס.אין אַדישאַן, MHC-I איז דאַונרעגיאַלייטיד אין 40-90% פון מענטשלעך טומאָרס און איז אָפט פארבונדן מיט אַ פּורער פּראָגנאָסיס19.
גענעס ינוואַלווד אין ריספּאַנדינג צו פּאַטאַדזשאַנז מוזן געשווינד באַשטימען צווישן אַ שטאַט פון מנוחה און אַ שטאַט פון אַקטיוו טראַנסקריפּציע.דעריבער, עטלעכע סעליאַלער פּראָטעינס זענען כייפּאַטאַסייזד צו זיין ינוואַלווד אין דער ענטפער צו הויך IFN פאָדערונג איבער קורץ פּיריאַדז, אַרייַנגערעכנט רימאַדאַלינג און מאָדיפיקאַטיאָן פון פּראָמאָטער טשראָמאַטין 20,21.רובֿ שטודיום האָבן פאָוקיסט אויף די לעגיטימאַציע פון ​​יחיד ISG פּראָטעין פּאַרטנערס אין דעם בייַזייַן פון IFN.עטלעכע פּראָטעאָמיק און טראַנסקריפּטאָמיק שטודיום אין מאָדעל צעל סיסטעמען האָבן ילוסידאַד די ווירקונג פון IFN אויף די סעליאַלער לאַנדשאַפט.אָבער, טראָץ אַ גראָוינג פארשטאנד פון די דינאַמיק ינדוסט דורך ינטערפעראָנס, מיר נאָך וויסן קליין וועגן די ינוואַלוומאַנט פון יסגס.ווען קאַנסידערינג די קאַמפּלעקסיטי און צייט-אָפענגיק דינאַמיק פון ינטערפעראָן סיגנאַלינג, צוויי פֿראגן אויפשטיין: (איך) איז עס מעגלעך צו סטייבאַלייז און טראַפּ די מולטיפּראָטעין קאַמפּלעקסאַז ינוואַלווד אין שנעל סיגנאַלינג, און (ii) קענען די ינטעראַקשאַנז זיין מאַפּט אין 3 ד פּלאַץ?
צו אַדרעס די ישוז, מיר ימפּלאַמענאַד דיסוקסינימידע סובעראַטע-מעדיאַטעד כעמישער קראָס-לינקינג (DSS) קאַפּאַלד מיט מאַסע ספּעקטראָמעטרי (CLMS) צו לערנען די IFNα-ינדוסט פּראָטעין ינטעראַקשאַן נעץ און זייַן דינאַמיק.DSS מוסיף קאָוואַלענט קייטן צווישן פּראַקסימאַל רעזאַדוז פון פּראָטעינס און / אָדער פּראָטעין קאַמפּלעקסאַז אין וויוואָו.סאַבסאַקוואַנט MS אַנאַליסיס ריווילז ספּעציפיש קראָססלינקינג זייטלעך וואָס פאַרטראַכטנ זיך די ספּיישאַל פּראַקסימאַטי פון מקומות אין אַ באַזונדער פּראָטעין, גערופֿן ינערלעך לינגקאַדזשאַז, אָדער סובוניץ אין פּראָטעין קאַמפּלעקסאַז, גערופֿן ינטעררעלאַטיאָנשיפּס.מיט דעם צוגאַנג, מיר האָבן יידענאַפייד עטלעכע ראָמאַן פּראָטעין-פּראָטעין קאַמפּלעקסאַז און ינטערפעראָן-ינדוסט מולטיפּראָטעין ינטעראַקשאַן נעטוואָרקס.דורך ווייַטער טעסטינג אַ סאַבסעט פון די נייַע ינטעראַקשאַנז, מיר באַווייַזן אַז H2BFS (H2B היסטאָנע-טיפּ FS; דערנאָכדעם ריפערד צו ווי H2B) און MDN1 אַקט ווי ביינדינג פּאַרטנערס פֿאַר HLA-A.
פלאָ-1 סעלז זענען איינער פון די מערסט באַוווסט אין וויטראָ מאָדעלס פון עסאָפאַגעאַל אַדענאָקאַרזינאָמאַ ווייַל זיי נאָכקרימען די שליסל פֿעיִקייטן פון עסאָפאַגעאַל טומאָרס22,23.אָבער, ניט אַלע טומאָרס זענען ימיונאַדזשעניק, און צו באַשליסן אויב Flo-1 סעלז ריספּאַנד צו ינטערפעראָן באַהאַנדלונג, מיר באהאנדלט Flo-1 סעלז מיט 10 נג / מל IFNα פֿאַר 72 שעה.פלאָ-1 סעלז געוויזן פרי ינדאַקשאַן פון pSTAT1 און IRF1, סטאַרטינג 2 שעה נאָך באַהאַנדלונג און קאַנטיניוינג פֿאַר 72 שעה, מיט אַ צייט-אָפענגיק פאַרקלענערן אין סטיישאַנערי לעוועלס פון IRF1 (פיגורע 1 אַ).ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2, און ISG15) זענען געפֿונען שטארק ינדוסט נאָך 6 שעה, נאָכקרימען די קלאַסיש מיטן און שפּעט פאַסע רעספּאָנסעס צו IFNα (פיגורע 1 אַ).צוזאַמען, די דאַטן פֿאָרשלאָגן אַז דעם סעליאַלער מאָדעל קענען זיין געוויינט צו לערנען ינטערפעראָן רעספּאָנסעס.
דיפערענטשאַל פּראָטעין אויסדרוק רעספּאָנסעס אין פלאָ-1 סעלז נאָך IFNα באַהאַנדלונג.(א) פּראָטעין אויסדרוק אין פלאָ-1 סעלז באהאנדלט מיט 10 ng / ml IFNα פֿאַר 2, 6, 24, 48 און 72 שעה איז אַנאַלייזד דורך ימיונאָבלאָץ ניצן די ימסיגהט אַנטיבאָדיעס.(ב) Coomassie בלוי סטיינד SDS-PAGE דזשעלז פון גאַנץ צעל עקסטראַקץ נאָך קרייַז-לינקינג מיט DSS פֿאַר אנגעוויזן צייט און קאַנסאַנטריישאַנז.(C) רעפּריזענאַטיוו יממונאָבלאָט יגזאַמאַנד מיט פּ53 (DO-1) אַנטיבאָדי פון די זעלבע סאַמפּאַלז צו אַססעסס די גראַד פון פּראָטעין קרייַז-פֿאַרבינדונג.
צו כאַפּן די אין סיטו פּראָטעין ינטעראַקשאַן לאַנדשאַפט, מיר געוויינט DSS, אַ וויידלי געוויינט קרייַז-לינקינג אַגענט רעכט צו זיין הויך מעמבראַנע לעדוירעס און לעפיערעך קורץ אָפּרוף צייט.די קירצער אָפּרוף צייט העלפט צו פאַרמייַדן די פאָרמירונג פון גרויס אַגגרעגאַץ פון קראָססלינקעד פּראָטעינס, דערמיט מיינטיינינג די פעסטקייַט פון די קראָססלינקער.צו באַשטימען די אָפּטימאַל DSS קאַנסאַנטריישאַן און ויסמיידן איבער-קראָססלינגקינג, מיר ערשטער יקספּאָוזד די סעלז צו 5, 2.5 און 1 מם DSS פֿאַר 5, 10, 5 און 30 מינוט ריספּעקטיוולי, און אַנאַלייזד די ליסאַטעס דורך Coomassie-סטיינד SDS-PAGE (דאַטן ניט געוויזן).צעל ליסאַטעס דערשייַנען צו זיין העכסט קרייַז-לינגקט אין די לאָואַסט קאַנסאַנטריישאַן און אין די שאָרטיסט צייט פונט.דעריבער, DSS איז טיטרייטיד צו 1, 0.5 און 0.1 מם איבער 5 מינוט (פיגורע 1 ב).אָפּטימאַל קראָססלינקינג איז באמערקט מיט 0.5 מם דסס פֿאַר 5 מינוט, און די באדינגונגען זענען אויסדערוויילט פֿאַר סעלז באהאנדלט מיט IFNα.אין אַדישאַן, פיגורע 1C ווייזט אַ מערב בלאָט דורכגעקאָכט מיט די פּ53 (DO-1) אַנטיבאָדי צו אַססעסס די גראַד פון פּראָטעין קרייַז-לינקינג.
פלאָ-1 סעלז זענען באהאנדלט מיט 10 נג / מל IFNα פֿאַר 24 שעה איידער אַדינג די קראָססלינקער.קראָס-לינגקט סעלז זענען דערנאָך ליסעד דורך צוויי-שריט פּראָטעאָליסיס און פּראָטעינס זענען פּראַסעסט דורך FASP (Fig. 2) 24,25.קרייַז-לינגקט טריפּטיק פּעפּטיידז זענען אַנאַלייזד דורך מאַסע ספּעקטראָמעטרי (Fig. 2).די MS / MS ספּעקטראַ זענען מאַטשט צו די פּראָטעין סיקוואַנס און קוואַנטאַפייד מיט MaxQuant26,27.קראָס-לינגקט פּעפּטיידז זענען יידענאַפייד פֿון די באקומען ספּעקטראַ ניצן די SIM-XL פּראָגראַם, און יחיד קאַמפּאַונדז זענען קאַמביינד אין אַ קאָמפּלעקס נעץ ניצן די קקוועסט28 און SIM-XL29 עפֿענען מקור קאַמפּיוטינג ווייכווארג פּייפּליינז (Fig. 2).SIM-XL יידענאַפייד פּראָטעין-פּראָטעין ינטעראַקשאַנז, ינערלעך קייטן און יחיד קייטן אין פּשוט אָדער קאָמפּלעקס פּראָטעין מיקסטשערז און גיט סקריפּס פֿאַר וויזשוואַלייזינג ינטעראַקשאַנז אין פּראָטעין סטראַקטשערז.אין אַדישאַן, עס רייען יעדער קרייַז-דערמאָנען ווי אַ שייַן כעזשבן לויט די MS / MS29 ספּעקטרום קוואַליטעט.עטלעכע העכסט פאַרלאָזלעך פּראָטעין-פּראָטעין ינטעראַקשאַנז און קאַמפּלעקסאַז האָבן שוין יידענאַפייד, און אַ נייַע גאַנג פון ינטעראַקשאַנז איז געווען ווייַטער ינוועסטאַגייטאַד ניצן קאָ-יממונאָפּרעסיפּיטאַטיאָן און קאַנפאָרמיישאַן ענדערונגען פון קאַמפּלעקסאַז ניצן מאָלעקולאַר דינאַמיק (מד) מאָדעלינג (Fig. 2) 30, 31.
סכעמאַטיש איבערבליק פון די CLMS אופֿן.פלאָ-1 סעלז זענען באהאנדלט מיט 10 נג / מל IFNα פֿאַר 24 שעה נאכגעגאנגען דורך אין סיטו פּראָטעין קרייַז-לינקינג ניצן DSS נאכגעגאנגען דורך צעל ליסיס און טריפּסיניזאַטיאָן.קראָס-לינגקט סאַמפּאַלז זענען אַנאַלייזד מיט אַ אָרביטראַפּ מאַסע ספּעקטראָמעטער און ווייַטער סאַמפּאַלד פֿאַר פראַגמאַנטיישאַן פון פּעפּטייד פּריקערסערז בעשאַס LC-MS / MS.צוויי לינגקט פּעפּטיידז זענען יידענאַפייד פֿון די באקומען ספּעקטראַ מיט די ספּעקטרום רעקאָגניטיאָן מאַשין פון די קראָססלינקעד פּעפּטיידז (SIM-XL) פּראָגראַם, און אַלע קאַמפּאַונדז זענען קאַמביינד אין אַ קאָמפּלעקס נעץ מיט קאַמפּיוטיישאַנאַל פּייפּליינז.פילטער אויס ינטעראַקשאַנז מיט נידעריק בטחון באזירט אויף פאַלש positive קורס (FDR) סקאָרז.עטלעכע נייַע ינטעראַקשאַנז מיט הויך-פאַדעלאַטי פּראָטעין-פּראָטעין זענען נאָך באשטעטיקט מיט קאָ-יממונאָפּרעסיפּיטאַטיאָן, און קאַנפאָרמיישאַן ענדערונגען אין די קאַמפּלעקסאַז זענען יגזאַמאַנד מיט מאָלעקולאַר דינאַמיק (מד) מאָדעלינג.
א גאַנץ פון ~ 30,500 און ~ 28,500 פּעפּטיידז זענען דיטעקטאַד ניצן מאַקסקוואַנט אין אַנסטימיאַלייטיד און סטימיאַלייטאַד IFNα סאַמפּאַלז, ריספּעקטיוולי (סופּפּלעמענטאַרי טאַבלע ס 1, פיג. 3 אַ).די פּעפּטייד לענג פאַרשפּרייטונג אין ביידע קאַסעס געוויזן אַ העכער פּראָפּאָרציע פון ​​גרעסערע פּעפּטיידז, ינדאַקייטינג דעם בייַזייַן פון קרייַז-לינגקט פּעפּטיידז (Fig. 3B, C).אין דערצו, אַ גרעסערע פּראָפּאָרציע פון ​​גרעסערע פּעפּטיידז זענען פאָרשטעלן אין די 40-55 קייט אין IFNα-באהאנדלט סאַמפּאַלז (Fig. 3C).פּראָטעין מאַפּינג קעגן לאָג 2 ינטענסיטי געוויזן אַז קלאַסיש ינטערפעראָן-סטימיאַלייטיד פּראָטעינס זענען די מערסט שעפעדיק קאַמפּערד מיט אַנטריטיד סאַמפּאַלז, אַרייַנגערעכנט MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 און HLA-F (פיגורע 3 ד).אַנאַליסיס פון פּאַטווייז פֿאַר פּראָטעינס מער ווי דריי-פאַרלייגן ענריטשט אין ענטפער צו IFNα באַהאַנדלונג מיט די רעאַקטאָמע פּאַטוויי דאַטאַבייס געוויזן אַז MHC-I-מעדיאַטעד אַנטיגען פּרעזענטירונג און פּראַסעסינג איז די מערסט דאָמינאַנט פּאַטוויי (פיגורע 3E).קאָנסיסטענט מיט פריער ריפּאָרץ, אַנטיוויראַל רעספּאָנסעס מידיייטיד דורך OAS און ISG15 ווי געזונט ווי IFNα / β און סיטאָקינע סיגנאַלינג זענען צווישן די פּאַטווייז אַקטיווייטיד.אין אַדישאַן, ליסין- און סערינע-ספּעציפיש פּראָטעין קרייַז-לינקס זענען יידענאַפייד פֿון די ערידזשנאַלי קונה MS / MS ספּעקטראַ ניצן SIM-XL.א פריש לערנען געמאלדן 104 יסג ס ספּאַנינג 20 ווירוסעס פון 9 ווירוס קלאסן דורך מעטאַ-אַנאַליסיס פון יחיד יסג אָוווערעקספּרעססיאָן שטודיום אין 5 צעל טייפּס9.אָבער, צו באַקומען די קאַמפּיוטיישאַנאַל לימיטיישאַנז פון זיפּונג גרויס דאַטאַסעץ, מיר סטאַרטעד מיט אַ קלענערער דאַטאַסעט צו ויספאָרשן מעגלעך ינטעראַקשאַנז צווישן די רשימה פון IRDS גענעס רעפּאָרטעד דורך Padaria עט על., רובֿ פון וואָס זענען ISGs.
לעגיטימאַציע פון ​​דיפערענטשאַלי אויסגעדריקט קראָס-לינגקט פּראָטעינס אין ענטפער צו IFNα (דאַטן באקומען פון MaxQuant).(א) Venn דיאַגראַמע רעפּריזענטינג די נומער פון פּראָסט און ויסשליסיק פּעפּטיידז יידענאַפייד אין IFNα14 באהאנדלט און אַנטריטיד Flo-1 סאַמפּאַלז.פאַרשפּרייטונג פון פּעפּטייד לענג פון אַנטריטיד (ב) און IFNα באהאנדלט (C) קראָססלינגקעד סאַמפּאַלז.(ד) היץ מאַפּע רעפּריזענטינג לאָג2 (LFQ ינטענסיטי) צווישן אַנטריטיד און IFNα14 באהאנדלט פלאָ-1 סעלז.די לינקס טאַפליע ווייזט די פּראָטעינס מערסט אַקטיוולי אַקטיווייטיד אין דעם בייַזייַן פון IFNα.(E) היסטאָגראַם רעפּריזענטינג די 20 הויפּט ענריטשמענט פּאַטווייז נאָך IFNα באַהאַנדלונג.די רעאַקטאָמע פּאַטוויי דאַטאַבייס אַנאַלייזד מער ווי פיר-פאַרלייגן ענדערונגען אין אַפּרעגיאַלייטיד IFNα-אָפּרופיק פּראָטעינס.
ינטערפעראָן-מעדיאַטעד ISG סטימיאַליישאַן איז געזונט דאַקיאַמענטאַד, אָבער אויף די מאָלעקולאַר מדרגה עס איז שוואַך פארשטאנען ווי די פּראָטעינס קאַלמאַנייט אין אַ ברייט קייט פון בייאַלאַדזשיקאַל פאַנגקשאַנז.מיר ינוועסטאַגייטאַד פּראָטעין ינטעראַקשאַנז מיט אַ הויך גראַד פון בטחון צווישן באַוווסט ISGs.ינטערעסטינגלי, מיר יידענאַפייד אַ נעץ אַרייַנגערעכנט MX1, USP18, ROBO1, OAS3 און STAT1 פּראָטעינס וואָס פאָרעם אַ גרויס קאָמפּלעקס אין ענטפער צו IFNα באַהאַנדלונג (פיגורע 4, טאַבלע S2) 32,33,34.רובֿ ימפּאָרטאַנטלי, די ינטעראַקשאַנז זענען געפֿונען אין אַלע טריפּליקאַטן באהאנדלט מיט IFNα און זענען נישט געפֿונען אין אַנטריטיד סאַמפּאַלז, סאַגדזשעסטינג אַז זיי זענען געשאפן ספּאַסיפיקלי אין ענטפער צו IFNα באַהאַנדלונג.עס איז באַוווסט אַז STAT1 טראַנסקריפּטיאָנאַללי רעגיאַלייץ די אויסדרוק פון די יסגס, אָבער זייַן ינטעראַקשאַן מיט יסגס אויף די פּראָטעין מדרגה איז נישט געלערנט.די קריסטאַל סטרוקטור פון STAT1 געוויזן אַז זיין כעליקאַל פעלד (CCD) איז נישט ינוואַלווד אין די ינטעראַקשאַן מיט דנאַ אָדער פּראָטאָמערז בעשאַס די פאָרמירונג פון דימערס35.די α-העליקס פאָרעם אַ כעליקאַל כיליקס סטרוקטור וואָס גיט אַ פּרידאַמאַנאַנטלי כיידראָופיליק ייבערפלאַך געגנט פֿאַר ינטעראַקשאַנז צו פּאַסירן 35 .אין אונדזער CLMS דאַטן, מיר באמערקט אַז רובֿ פון די ינטעראַקשאַנז מיט STAT1 פארגעקומען אין די SH2 פעלד פּריסידינג די CCD, די לינקער פעלד אָדער די C-וואָקזאַל עק (רעזאַדז 700-708) (פיגורע 4 אַ).א פריערדיקן לערנען געמאלדן אַז USP18 ביינדז צו די קקד און דנאַ-ביינדינג פעלד (דבד) פון STAT2 און איז ריקרוטיד צו די סובוניט פון די טיפּ איך ינטערפעראָן רעסעפּטאָר IFNAR2 צו פאַרמיידן ינאַבישאַן פון טיפּ איך ינטערפעראָן סיגנאַלינג 24.אונדזער דאַטן אויך געוויזן אַז די USP18 קאַטאַליטיק פעלד ינטעראַקץ מיט STAT1 DBD (פיגורע 4A,D), סאַגדזשעסטינג אַז ביידע STAT1 און STAT2 קען שפּילן אַ ראָלע אין אַטראַקטינג USP18 צו IFNAR2.
פּראָטעין-פּראָטעין ISG נעץ יידענאַפייד אין קרייַז-לינגקט סעלז באהאנדלט מיט IFNα.(א) 2 ד ינטעראַקשאַן פּלאַנעווען ווייזונג פּראָטעין-פּראָטעין ינטעראַקשאַנז (דזשענערייטאַד אין די SIM-XL פּראָגראַם), מיט שורות רעפּריזענטינג ינטערמאָלעקולאַר ינטעראַקשאַנז (קראָססלינק קאַטאָף שטעלן צו 3.5).דאָומיינז פון פאַרשידענע אידענטיטעט זענען אנגעצייכנט דורך זייער קאָליר 32: MX1 פעלד, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547), און GED (569–660).OAS3 דאָומיינז: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), און OAS1_C (903-108).פעלד ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) און fn3 (777–864).STAT1 פעלדער: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), און STAT1_TAZ2bind (715–739).(ב) קייַלעכיק צוקוקער פון קראָס-לינגקט פּראָטעינס (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 און STAT1) מיט ינטעראַקשאַנז און ינטעראַקשאַנז מיט בלוי און רויט ריספּעקטיוולי.די קרייַז-לינק שוועל איז געווען באַשטימט צו 3.5.פּונקט פּלאַץ אָנווייַזן STAT1 ינטעראַקשאַן זייטלעך מיט MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), און OAS3 (F), ווי געזונט ווי K אָדער S ינטעראַקשאַן זייטלעך צווישן די צוויי פּעפּטיידז.אין די פיגור, די קרייַז-לינק כעזשבן שוועל איז באַשטימט צו 3.0.(ג) פאַרשידן ינטעראַקשאַן זייטלעך צווישן STAT1 און OAS3 DI דאָומיינז סופּעראַמפּאָוזד אויף זייער פּראָטעין סטראַקטשערז אין PyMol (PyMOL מאָלעקולאַר גראַפיקס סיסטעם, ווערסיע 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (פּדב שייַן: 1bf533) און אָאַס3 (פּדב שייַן: 4s3n34).) פּראָגראַם.
צוויי יסאָפאָרמס פון USP18 האָבן שוין דיסקרייבד אין יומאַנז, אַ פול-לענג פּראָטעין וואָס איז פּרידאַמאַנאַנטלי ליגן אין די קערן, און אַן יסאָפאָרם אָן אַ N-וואָקזאַל פעלד, USP18-sf, וואָס איז יוואַנלי פונאנדערגעטיילט אין די סיטאָפּלאַסם און קערן 36.אין אַדישאַן, די N-טערמינוס איז פּרעדיקטעד צו זיין אַנסטראַקטשערד און טוט נישט דאַרפן יסאָפּעפּטידאַסע טעטיקייט אָדער ISG1537 ביינדינג.רובֿ פון די ינטעראַקשאַנז יידענאַפייד אין אונדזער לערנען זענען ליגן אין די N-טערמינוס פון דעם פּראָטעין, סאַגדזשעסטינג אַז די ינטעראַקשאַנז אַרייַנציען פול-לענג USP18 (פיגורע 4A,D) און אַזוי מסתּמא פאַלן אין די קערן.דערצו, אונדזער דאַטן אויך אָנווייַזן אַז די N-טערמינוס איז ספּעשאַלייזד פֿאַר פּראָטעין-צו-פּראָטעין ינטעראַקשאַנז.די IFNAR2 ביינדינג פּלאַץ איז ליגן צווישן רעזאַדוז 312-368, און נאָוטאַבלי, קיינער פון די פּראָטעינס אין דעם קאָמפּלעקס בינדן צו דעם געגנט (Fig. 4A) 37,38.די דאַטן צוזאַמען אָנווייַזן אַז די IFNAR2 ביינדינג פעלד איז אויסשליסלעך געניצט דורך די רעסעפּטאָר פּראָטעין.אין אַדישאַן, בלויז OAS3 און ROBO1 זענען געווען פארבונדן מיט דאָומיינז אַפּסטרים פון די N-terminus און IFNAR2 ביינדינג פּלאַץ (פיגורע 4A).
ROBO1 געהערט צו די יממונאָגלאָבולין (יג) סופּערפאַמילי פון טראַנסמעמבראַנע סיגנאַלינג מאַלאַקיולז און באשטייט פון פינף יג דאָומיינז און דריי פיבראָנעקטין (Fn) דאָומיינז אין די עקסטראַסעללולאַר געגנט.די עקסטראַסעללולאַר דאָומיינז זענען נאכגעגאנגען דורך אַ מעמבראַנע-פּראָקסימאַל געגנט און אַ איין טראַנסמעמבראַנע כיליקס 39. אַ אַנסטראַקטשערד ינטראַסעללולאַר געגנט איז ליגן בייַ די C-טערמינוס און כּולל קאַנסערווד סיקוואַנס מאָוטיפס וואָס פאַרמיטלען ווירקונגאָר פּראָטעין ביינדינג39.דער געגנט יקסטענדינג פון אַמינאָ אַסאַדז ~ 1100 צו 1600 איז מערסטנס דיסאָרדערד.מיר געפֿונען אַז MX1 ינטעראַקץ מיט ROBO1 דורך Ig, Fn און ינטראַסעללולאַר דאָומיינז, בשעת רובֿ ינטעראַקשאַנז מיט STAT1 פאַלן צווישן די CCD, לינקער פעלד און די C-טערמינוס פון ROBO1 (Fig. 4A,E).אויף די אנדערע האַנט, ינטעראַקשאַנז מיט DI, DIII און OAS3 לינקער מקומות זענען פונאנדערגעטיילט איבער די ROBO1 פּראָטעין (Fig. 4A).
די אָליגאָאַדענילאַטע סינטאַסיס (אָאַס) פּראָטעין משפּחה אַקסעפּץ און ביינדז ינטראַסעללולאַר טאָפּל-סטראַנדיד רנאַ (דסרנאַ), אַנדערגאָוז קאַנפאָרמיישאַן ענדערונגען, און סינטאַסייזיז 2′,5′-לינגקט אָליגאָואַדענילאַטעס (2-5 ווי) 40.עס איז געפונען אַז צווישן די דריי אָאַסס, OAS3 יגזיבאַץ די העכסטן קירבות פֿאַר דסRNA און סינטאַסייזיז די מינדסטער סומע פון ​​2-5 ווי, וואָס קענען אַקטאַווייט רנאַסע ל און דערמיט באַגרענעצן וויראַל רעפּלאַקיישאַן 41.די OAS משפּחה באשטייט פון פּאָלימעראַסע ביתא (פּאָל-β)-ווי נוקלעאָטידע טראַנספעראַסע דאָומיינז.פריער פאָרשונג האט געוויזן אַז די קאַטאַליטיק טעטיקייט פון די C-וואָקזאַל פעלד (DIII) איז אָפענגיק אויף די דסRNA-ביינדינג פעלד (DI), וואָס איז פארלאנגט פֿאַר די אַקטאַוויישאַן פון OAS342.מיר באמערקט אַז די DI און DII דאָומיינז פון OAS3 ינטעראַקט מיט CCD און אַ קליין קנופּ געגנט צווישן SH2 און STAT1 TAD (פיגורע 4A,F).אָוווערלייינג פאַרשידענע קראָססלינקינג זייטלעך אויף די פּראָטעין סטרוקטור אנטפלעקט אַ ינטעראַקשאַן צווישן די β-בלאַט און DBD STAT1 שלייף און אַ עפענען קעשענע אָדער קאַוואַטי געשאפן דורך רעזאַדוז 60-75 אין די די פעלד פון OAS3 (Fig. 4G).די אָריענטירונג פון די פּראָטעינס אין דעם קאָמפּלעקס אויך אנגעוויזן אַז קיין פון די ינטעראַקשאַנז מיט אָאַס3 ינטערפירד מיט די דנאַ-ביינדינג פיייקייט פון זייַן די פעלד (Fig. S1A).אין אַדישאַן, די N-וואָקזאַל פעלד פון GTPase MX1 ינטעראַקץ יקסטענסיוולי מיט די DI און DIII דאָומיינז פון OAS3 (Fig. 4A).מיר אויך באמערקט אַ ינטעראַקשאַן צווישן OAS1 און MX1 אין אַלע דריי IFNα-באהאנדלט ריפּיץ, ווו אַ איין OAS1 פעלד (אויך קאַטאַליטיקלי אַקטיוו) ינטעראַקטיד מיט אַלע דריי MX1 דאָומיינז (פיגורע S2A,B).
מקס פּראָטעינס זענען טייל פון אַ גרויס משפּחה פון דינעין-ווי GTPases וואָס אַנטהאַלטן אַן N-וואָקזאַל GTPase פעלד וואָס ביינדז און כיידראַליזיז GTP, אַ ינטערמידייט פעלד וואָס מידיייץ זיך-פֿאַרזאַמלונג, און אַ C-וואָקזאַל לעוסינע זיפּפּער וואָס אַקט ווי אַ GTPase (LZ) ).פעלד עפפעקטאָר domain25,43.MX1 ביינדז צו סאַבוניץ פון וויראַל פּאָלימעראַסעס צו פאַרשפּאַרן טראַנסקריפּציע פון ​​די וויראַל גענע43.א פריער געמאלדן הייוון צוויי-כייבריד פאַרשטעלן האט געוויזן אַז PIAS1-פארבונדן MX1 ינכיבאַץ STAT1-מעדיאַטעד דזשין אַקטאַוויישאַן דורך בלאַקינג דנאַ-ביינדינג טעטיקייט און אויך האט SUMO E344,45 ליגאַסע טעטיקייט.דאָ, מיר באַווייַזן אַז MX1 ביינדז צו STAT1 (פיגורע 4C, D), אָבער ווי די ינטעראַקשאַן אַפעקץ STAT1-מעדיאַטעד דזשין אַקטאַוויישאַן אין ענטפער צו IFNα דאַרף ווייַטער לערנען.אין אַדישאַן, מיר אויך געפֿונען אַז MX1 ינטעראַקטיד מיט IFIT3 און DDX60 אין אַלע דריי IFNα-באהאנדלט ריפּיץ (Fig. S2C).
DDX60 איז אַן IFN-ינדוסט סיטאָפּלאַסמיק העליקאַסע וואָס איז פריער געמאלדן צו שפּילן אַ ראָלע אין RIG-I-פרייַ דערנידעריקונג פון וויראַל רנאַ46.עס ינטעראַקץ מיט RIG-I און אַקטאַווייץ זייַן סיגנאַלינג אין אַ ליגאַנד-ספּעציפיש שטייגער 46. DDX60 באשטייט פון אַ דעקסד / ה-באָקס העליקאַסע פעלד און אַ C-וואָקזאַל העליקאַסע פעלד וואָס בינדן וויראַל רנאַ און דנאַ47.רובֿ פון זייַן ינטעראַקשאַנז מיט MX1 און IFIT3 פאַלן אין לאַנג N- און C-וואָקזאַל מקומות אָן קאַנאָניקאַל דאָומיינז אָדער מאָוטיפס (Fig. S2E,F).אָבער, MX1 איז אויך פֿאַרבונדן מיט די DEXD / H-Box העליקאַסע פעלד (Fig. S2E).פּראָטעינס פון די IFIT משפּחה האָבן טאַנדאַם קאפיעס פון אַ אָפּשיידנדיק כיליקס-קער-העליקס מאָטיף גערופן די טעטראַפּעפּטידע איבערחזרן (טפּר).IFIT3 איז געפונען צו זיין אַ positive מאָדולאַטאָר פון RIG-I סיגנאַלינג און דערפאר אַ קאָמפּאָנענט פון די MAVS קאָמפּלעקס.צוזאַמען, אונדזער דאַטן פֿאָרשלאָגן אַז IFIT3 און DDX60 ינטעראַקט בפֿרט אין דער געגנט צווישן TPR 3-6 פון IFIT3 און קען שפּילן אַ ראָלע אין RIG-I / MAVS סיגנאַלינג (Fig. S2F).
זינט די זיפּונג פון די גאנצע פּראָטעאָמע איז קאַמפּיוטישאַנאַלי אינטענסיווע, מיר דאַן סקרינד די גאנצע מענטשלעך UniProt דאַטאַבייס פֿאַר דעם בייַזייַן פון איינער פון די IFNα-באהאנדלט ריפּיץ.אין דעם רעפּליקע, מיר געפֿונען עטלעכע העכסט פאַרלאָזלעך ינטעראַקשאַן נעטוואָרקס פֿאַר HLA-A.אַנאַליסיס פון פּראָטעין פּאַטווייז יידענאַפייד דורך MS / MS ספּעקטראַ געוויזן אַז MHC-I-באזירט אַנטיגען פּראַסעסינג און פּרעזענטירונג איז די הויפּט פּאַטוויי ינדוסט דורך ינטערפעראָן (Fig. 3D).דעריבער, מיר פאָוקיסט אויף לערנען די פּראָטעין ינטעראַקשאַנז פון MHC-I מאַלאַקיולז מיט אַ הויך גראַד פון בטחון אין אַלע קרייַז-לינגקט סאַמפּאַלז.HLA באשטייט פון α1, α2 און α3 דאָומיינז און ליכט קייטן, און מיקראָגלאָבולין β2 (β2m) איז אַ קעסיידערדיק טשאַפּעראָנע פּראָטעין49.אַמאָל אַסעמבאַלד אין די ענדאָפּלאַסמיק רעטיקולום, HLA איז אַנסטייבאַל אין דער אַוועק פון פּעפּטייד ליגאַנדז50.די פּעפּטייד-ביינדינג נאָרע איז געשאפן דורך די העכסט פּאַלימאָרפיק און אַנסטראַקטשערד α1 און α2 דאָומיינז אין ניט-פּעפּטייד פאָרעם און די לעפיערעך ווייניקער פּאַלימאָרפיק α351 פעלד.אין דעם בייַזייַן פון IFNα, מיר דיטעקטאַד צוויי HLA-A קאַמפּלעקסאַז: איינער ינטעראַקץ מיט HMGA1 און H2B (פיגורע 5, טיש ס 3) און די אנדערע ינטעראַקץ מיט MDN1, LRCH4 און H2B (פיגורע 6).
IFNα ינדוסיז אַן HLA-A ינטעראַקשאַן נעץ מיט H2B (H2BFS) און HMGA1.(א) 2 ד פּלאַנעווען (דזשענערייטאַד אין SIM-XL ווייכווארג) דיפּיקטינג פאַרשידענע טייפּס פון ינטעראַקשאַנז אין די H2B-HLA-A-HMGA1 קאָמפּלעקס: ינטערלינק (בלוי), ינטערלינק (רויט) און איין לינק (שוואַרץ)..דאָומיינז פון פאַרשידענע אידענטיטעט זענען קאָליר קאָדעד 32: H2B (היסטאָנע; 2-102) און MHC-I (MHC_1; 25-203, גרופּע C1; 210-290 און MHC_I_C; 337-364).די קרייַז-לינק שוועל איז געווען באַשטימט צו 3.5.פּונקט פּלאַץ אָנווייַזן HLA-A ינטעראַקשאַן זייטלעך מיט H2B (B) און HMGA1 (C), ווי געזונט ווי K אָדער S ינטעראַקשאַן זייטלעך צווישן די צוויי פּעפּטיידז.אין די פיגור, די קרייַז-לינק כעזשבן שוועל איז באַשטימט צו 3.0.(ד) באַציונגען צווישן פּראָטעינס געוויזן אין די סטראַקטשערז פון די H2B, HLA-A און HMGA1 פּראָטעינס אין די PyMOL פּראָגראַם.די סטראַקטשערז זענען מאָדעלעד מיט די Phyre2 סערווער (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) און די מוסטער סטראַקטשערז פֿאַר די H2B, HLA-A און HMGA1 פּראָטעינס זענען ריספּעקטיוולי 1kx552, 1kj349 און 2eze55.
IFNα ינדוסיז אַן HLA-A ינטעראַקשאַן נעץ מיט H2B (H2BFS), MDN1 און LRCH4.(א) ינטראַמאָלעקולאַר (רויט) און ינטערמאָלעקולאַר (בלוי) קראָססלינקס דערלאנגט אויף אַ 2D ינטעראַקטיוו מאַפּע (דזשענערייטאַד אין SIM-XL ווייכווארג) מיט MDN1 רעפּריזענטיד ווי אַ קרייַז.די קרייַז-לינק שוועל איז געווען באַשטימט צו 3.5.דאָומיינז פון פאַרשידענע אידענטיטעט זענען קאָליר קאָדעד 32: H2B (היסטאָנע; 2-102), MHC-I (MHC_1; 25-203, גרופּע C1; 210-290 און MHC_I_C; 337-364) און LRCH4 (LRR_8 (68-126), LRR_8 (137-194) און CH (535-641)).(ב) באַציונגען צווישן פּראָטעינס געוויזן אין די סטראַקטשערז פון די H2B, HLA-A, LRCH4 און MDN1 פּראָטעינס אין די PyMOL פּראָגראַם.די סטראַקטשערז זענען מאָדעלעד מיט די Phyre2 סערווער (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) מיט מוסטער סטראַקטשערז 1kx552, 1kj349, 6hlu62 און 6i2665 פֿאַר די H2B, HLA-A, LRCH4 און MDN1 פּראָטעינס, ריספּעקטיוולי.פּונקט פּלאָץ וואָס ווייַזן K אָדער S ינטעראַקשאַן זייטלעך פֿאַר HLA-A מיט H2B (C), LRCH4 (D), און MDN1 (E).פֿאַר פּלאַץ, די קרייַז-לינק כעזשבן שוועל איז געווען באַשטימט צו 3.0.
אין אַדישאַן צו האַלטן די אָרנטלעכקייַט פון די גענאָמע, היסטאָנע H2B איז אויך ינוואַלווד אין די רעגולירן פון טראַנסקריפּציע.די H2B פּראָטעין באשטייט פון אַ הויפט היסטאָנע פעלד (HFD) געשאפן דורך דריי α-העליקס אפגעשיידט דורך לופּס און אַ C-וואָקזאַל עק 41,52.רובֿ פון די ינטעראַקשאַן מיט H2B אַקערז אין די α1 כיליקס, וואָס גיט טרימעריזיישאַן מיט די הפד העטעראָדימער (Fig. 5A,B).כאָטש ליסינס זענען ינוואַלווד אין דנאַ ביינדינג, עטלעכע ליסינס זענען אויך אָלטערנאַטיוו אַסעטילאַטיאָן אָדער מעטהילאַטיאָן זייטלעך.פֿאַר בייַשפּיל, רעזאַדוז K43, K46 און K57 פֿון H2B זענען נישט ינוואַלווד אין דירעקט דנאַ ביינדינג, אָבער זענען טאַרגאַץ פון פאַרשידן פּאָסט-טראַנסקריפּשאַנאַל מאָדיפיקאַטיאָנס.סימילאַרלי, רעזאַדוז K44, K47 און K57 אין H2B קען שפּילן אַן אָלטערנאַטיוו ראָלע אין דעם בייַזייַן פון IFNα, אַרייַנגערעכנט ינטעראַקשאַנז מיט אנדערע פּראָטעינס (Fig. 5A, B).אין אַדישאַן, די עקסטראַטשראָמאָסאָמאַל היסטאָנע H2B אַקטאַווייץ די ימיון ענטפער אין פאַרשידן צעל טייפּס, אַקטינג ווי אַ סיטאָסאָליק סענסער צו דעטעקט טאָפּל-סטראַנדיד דנאַ (דסדנאַ) פראַגמאַנץ דערייווד פון ינפעקטיאָוס אגענטן אָדער דאַמידזשד סעלז.אין דעם בייַזייַן פון דנאַ ווירוסעס, H2B דיפּלישאַן ינכיבאַטיד IFN-β פּראָדוקציע און STAT154 פאָספאָרילאַטיאָן.H2B איז אויך באקאנט צו מאַך אין און אויס פון די קערן פאַסטער ווי אנדערע האַרץ היסטאָנעס54.H2B ינטעראַקשאַנז מיט MDN1 און LRCH4 זענען אויך באמערקט אין אויסגעקליבן אַנטריטיד סאַמפּאַלז.מיר געפֿונען אַז HLA-A ינטעראַקטיד מיט H2B אין אַלע דריי IFNα-באהאנדלט סאַמפּאַלז און אין איין אַנטריטיד איבערחזרן מוסטער.די דאַטן פאַרטראַכטנ זיך די ראָלע פון ​​​​H2B אין אַן אָלטערנאַטיוו פיזיאַלאַדזשיקאַל פונקציע פרייַ פון טראַנסקריפּציע רעגולירן.
HMGA1 (הויך מאָביליטי גרופּע AT-Hook 1), אַ קליין נוקלעאָפּרוטין רייַך אין קרענק-פּראַמאָוטינג אַמינאָ אַסאַדז, איז יידענאַפייד אין פאַרבאַנד מיט HLA-A.עס האט אַ אַסידיק C-וואָקזאַל עק און דריי בוילעט דבד גערופֿן AT כוקס ווייַל זיי בינדן צו די מינערווערטיק נאָרע פון ​​די AT-רייַך געגנט אין דסDNA55,56.דעם ביינדינג ז די דנאַ צו בייגן אָדער ויסגלייַכן, אַלאַוינג קאַנאָניקאַל טראַנסקריפּציע סיבות צו אַקסעס זיין קאָנסענסוס סיקוואַנס.די C-וואָקזאַל עק איז געמיינט צו זיין ינוואַלווד אין פּראָטעין-פּראָטעין ינטעראַקשאַנז און די ראַקרוטמאַנט פון טראַנסקריפּציע סיבות, זינט C-וואָקזאַל דילישאַן מיוטאַנץ קענען נישט אָנהייבן טראַנסקריפּציע 57.דערצו, דעם פעלד כּולל עטלעכע קאַנסערווד פאָספאָרילאַטיאָן זייטלעך וואָס זענען באקאנט סאַבסטרייץ פֿאַר קינאַסעס 58.מיר באמערקט HLA-A און H2B ינטעראַקשאַנז מיט HMGA1 אַרויס די C-וואָקזאַל פעלד, סאַגדזשעסטינג אַז די C-וואָקזאַל פעלד איז דער הויפּט געניצט פֿאַר טראַנסקריפּציע פאַקטאָר ביינדינג (Fig. 5A, C).HMGA פּראָטעינס קאָנקורירן מיט היסטאָנע H1 פֿאַר ביינדינג צו אַדאַפּטער דנאַ, דערמיט ינקריסינג אַקסעסאַביליטי57.סימילאַרלי, עס מיינט מסתּמא אַז HMGA ינטעראַקץ מיט היסטאָנע H2B צוזאמען די לינקער דנאַ אין פאַרמעסט מיט היסטאָנע H1.HMGB1 ינדוסיז די אויסדרוק פון HLA-A, -B, און -C אין דענדריטיק סעלז, וואָס פירן צו זייער אַקטאַוויישאַן 59, אָבער אַ ינטעראַקשאַן צווישן HMG און HLA איז נישט פריער געמאלדן.מיר געפֿונען אַז HMGA1 ינטעראַקץ מיט די α1 און α3 דאָומיינז פון HLA-A, מיט רובֿ פון די ינטעראַקשאַנז אַרויס פון זייַן 3 דבד (פיגורע 5A, C).אין אונדזער הענט, HLA-A איז געווען לאָוקאַלייזד אין די קערן (דאַטן ניט געוויזן), און ווייַל H2B און HMGA1 זענען אויך פאָרשטעלן אין די קערן, די ינטעראַקשאַן איז מסתּמא אַקערז אין די קערן.ספּעציפיש אַדדוקץ געמאסטן צווישן H2B, HLA-A און HMGA1 זענען געוויזן אין פיגורע 5D.
רובֿ ינטעראַקשאַנז פון HLA-A מיט אנדערע פּראָטעינס פאַלן אין זייַן α1 און α2 דאָומיינז און די דיסאָרדערד C-וואָקזאַל פעלד (Fig. 6).אין איינער פון די ביישפילן, מיר געפֿונען אַז HLA-A ינטעראַקץ מיט די דיסאָרדערד N-וואָקזאַל עק פון LRCH4 (פיגורע 6A,D).LRCH4 רעגיאַלייץ TLR4 אַקטאַוויישאַן און לפּס סיטאָקינע ינדאַקשאַן, דערמיט מאַדזשאַלייטינג די ינייט ימיון ענטפער60,61.עס איז אַ מעמבראַנע פּראָטעין מיט נייַן לעוסינע-רייַך ריפּיץ (LRRs) און אַ קאַלמאָדולין (CH) כאָומאַלאַדזשי מאָטיף אין זייַן עקטאָדאָמאַין, נאכגעגאנגען דורך אַ טראַנסמעמבראַנע פעלד (TMD) 60, 62.טש דאָומיינז האָבן שוין רעפּאָרטעד צו מידיייט פּראָטעין-פּראָטעין ינטעראַקשאַנז 60.א אויסשטרעקן פון וועגן 300 אַמינאָ אַסאַדז צווישן די LRR און CH דאָומיינז איז לעפיערעך צוטריטלעך אָבער דיסאָרדערד.באַזירט אויף די פאַנגקשאַנז פון דיסאָרדערד מקומות ווי מעדיאַטאָרס פון פּראָטעין-פּראָטעין נעטוואָרקס און וועסיקולאַר אַריבערפירן 63, מיר געפֿונען אַז רובֿ פּראָטעין ינטעראַקשאַנז פאַלן אין דיסאָרדערד מקומות.ינטעראַקטיאָנס מיט MDN1 זענען פונאנדערגעטיילט איבער די לענג פון די פּראָטעין, אַרייַנגערעכנט די LRR1, LRR6, CH דאָומיינז און טראַפ מקומות, בשעת H2B דער הויפּט געבונדן צו די CH פעלד (Fig. 6A, B).נאָוטאַבלי, קיינער פון די ינטעראַקשאַנז ינקלודעד די TMJ, סאַגדזשעסטינג די ספּעציפֿישקייט פון די CLMS צוגאַנג (פיגורע 6 אַ, ב).
MDN1 איז אויך יידענאַפייד ווי אַ טייל פון די HLA-A פּראָטעין נעץ (פיגורע 6A).עס געהערט צו די אַאַאַ משפּחה פון פּראָטעינס (ATPases פֿאַרבונדן מיט פאַרשידענע אַקטיוויטעטן).דאָס איז דער זעלביקער N-וואָקזאַל אַאַאַ פעלד וואָס אָרגאַניזירט אין אַ העקסאַמעריק רינג און רימוווז די פֿאַרזאַמלונג פאַקטאָר פון די 60S 64 ריבאָסאָמאַל סובוניט.איז ענלעך צו דינעין64,65,66.אין אַדישאַן, די אַספּ / גלו רייַך געגנט איז נאכגעגאנגען דורך די MIDAS פעלד (מעטאַל יאָן אָפענגיק פּלאַץ).רעכט צו דער גרויס גרייס פון MDN1 (בעערעך 5600 אַמינאָ אַסאַדז) און זייַן לימיטעד כאָומאַלאַדזשי מיט געזונט-געלערנט פּראָטעינס, קליין איז באַוווסט וועגן זייַן סטרוקטור און פונקציע אין יומאַנז.מיר יידענאַפייד HLA-A, H2B, און LRCH4 ווי MDN1 ביינדינג פּאַרטנערס און אנטפלעקט זייער אָריענטירונג ווי פּראָטעין קאַמפּלעקסאַז אין PyMol (Fig. 6A, B).די דריי פּראָטעינס ינטעראַקט מיט די AAA פעלד, די דינעין-ווי לינקער פעלד און עפשער די MIDAS MDN1 פעלד.אין אַ פריערדיקן באַריכט, קירבות רייניקונג פון לעקעכל פּראָטעינס יידענאַפייד MDN1 ווי אַ פּראָטעין פֿאַרבונדן מיט היסטאָנע ה2ב67.אין אַדישאַן, אַ פריש לערנען אויך רעפּאָרטעד אַ ינטעראַקשאַן צווישן MDN און HLA-B אין HCT116 סעלז ניצן קירבות פּיוראַפייד מאַסע ספּעקטראָמעטרי, וואָס שטיצן אונדזער פיינדינגז68.די לעגיטימאַציע פון ​​דעם קאָמפּלעקס אין IFNα-באהאנדלט סאַמפּאַלז סאַגדזשעסץ אַ ראָלע פֿאַר MDN1 אין ינטערפעראָן סיגנאַלינג.
ווייַל HLA גענעס זענען העכסט פּאַלימאָרפיק, מיר יקסטראַקטיד סיקוואַנסינג מאַפּינג HLA-A, -B, און -C פֿון רנאַ סיקוואַנסינג דאַטן פון Flo-1 סעלז (דאַטע ניט געוויזן).פּעפּטייד סיקוואַנסיז קאָנסיסטענט מיט די סיקוואַנסינג לייענען אנטפלעקט באַטייַטיק דיפעראַנסיז צווישן HLA-A, -B, און -C אין מקומות ווו קרייַז-לינגקט פּעפּטיידז זענען ליגן אין HLA-A (פיגורע ס 3).אין אַדישאַן, מיר האָבן נישט אָבסערווירן פּראָטעין-צו-פּראָטעין קרייַז-לינקינג פון HLA-B/C מאַלאַקיולז מיט H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 פּראָטעינס.דאָס סאַגדזשעסץ אַז די פּראָטעין ינטעראַקשאַן צווישן HLA-A, MDN1, LRCH1 און HMGA1 איז HLA-A ספּעציפיש.אין אַדישאַן, פּראָטעאָמיק אַנאַליסיס פון ניט-קראָססלינגקעד סאַמפּאַלז (טאַבלע S4) געוויזן אַז HLA-A האט העכער סיקוואַנס קאַווערידזש קאַמפּערד מיט HLA-B אָדער HLA-C.די פּעפּטיידז יידענאַפייד פֿאַר HLA-A זענען הויך אין ינטענסיטי אין ביידע IFNα-באהאנדלט און אַנטריטיד סאַמפּאַלז.
צו ענשור אַז די ינטעראַקשאַנז יידענאַפייד דאָ זענען נישט רעכט צו ניט-ספּעציפיש קרייַז-לינקינג פון צוויי פּראָטעינס אין נאָענט ספּיישאַל פּראַקסימאַטי, מיר נאָך באשטעטיקט צוויי נייַע HLA-A ינטעראַקטינג סיבות דורך פּערפאָרמינג קאָ-יממונאָפּרעסיפּיטאַטיאָן אַסייס.HLA-A ינטעראַקשאַנז מיט ענדאָגענאָוס MDN1 און H2B זענען דיטעקטאַד אין ביידע IFNα-באהאנדלט און אַנטריטיד פלאָ-1 סעלז (פיגורע 7, פיגורע ס 4).מיר באשטעטיקט אַז HLA-A איז קאַפּטשערד דורך H2B אין די ימיונאָפּרעסיפּיטאַטעס און אַז דער פאַרבאַנד איז געווען רעכט צו IFNα באַהאַנדלונג זינט HLA-A איז ניטאָ אין די ימיונאָפּרעסיפּיטע סאַמפּאַלז פון אַנטריטיד סעלז (פיגורע 7A).אָבער, אונדזער דאַטן פֿאָרשלאָגן אַז IFNα דיפערענטשאַלי רעגיאַלייץ HLA-A ביינדינג צו H2B און MDN1.IFNα ינדוסיז אַ פאַרבאַנד צווישן H2B און HLA-A, אָבער ראַדוסאַז זיין פאַרבאַנד מיט MDN1.מיר געפֿונען אַז MDN1 איז געווען פֿאַרבונדן מיט HLA-A אין קאָנטראָלס, און די אַדישאַן פון IFNα רידוסט די ינטעראַקשאַן פרייַ פון MDN1 ינדאַקשאַן דורך IFNα (פיגורע 7B, C).אין דערצו, HLA-A יממונאָפּרעסיפּיטאַטיאָן קאַפּטשערד ה2ב אין אַ549 סעלז (Fig. S4), סאַגדזשעסטינג אַז דעם ינטעראַקשאַן איז פרייַ פון צעל טיפּ.צוזאַמען, די רעזולטאַטן שטיצן ינטערפעראָן-מעדיאַטעד ינטעראַקשאַנז פון HLA-A מיט H2B און MDN1.
HLA-A קאָ-רייניקט H2B און MDN1.רעפּריזענאַטיוו ענדאָגענאָוס H2B (א) און MDN1 (ב) ימיונאָבלאָץ זענען ימיונאָפּרעסיפּיטאַטעד פֿון IFNα-באהאנדלט פלאָ-1 סעלז און פּראָוד פֿאַר די אנגעוויזן אַנטיבאָדיעס.מויז און קיניגל יגג זענען געניצט ווי אַ נעגאַטיוו קאָנטראָל.(C) קאָרעוו אַמאַונץ (אַרייַנשרייַב) פון פאַרשידענע אַנטיגענס זענען דיפּיקטיד דורך ימיונאָבלאָץ פּראָוד קעגן ינדיקייץ אַנטיבאָדיעס, β-אַקטין איז געניצט ווי אַ לאָודינג קאָנטראָל.
די סטראַקטשעראַל פּראָפּערטיעס פון איינער פון די ינטערפעראָן-ינדוסט העכסט פאַרלאָזלעך קרייַז-לינגקט נעטוואָרקס, H2B-HLA-A-HMGA1, זענען ינוועסטאַגייטאַד.מיר געוויינט מאָלעקולאַר דינאַמיק מאָדעלינג ווי אַן אָלטערנאַטיוו צוגאַנג צו פֿאַרשטיין די קאַנפאָרמיישאַן דינאַמיק פון די פּראָטעינס ינוואַלווד אין דעם קאָמפּלעקס (פיגורע 8).ינפעראַנס פון די CLMS דאַטן פֿאָרשלאָגן די מעגלעכקייט פון פאַרשידענע קאַנפאָרמיישאַנז פון די H2B, HLA-A און HMGA1 פּראָטעינס.דעריבער, די פאלגענדע פּאָטענציעל קאַמפּלעקסאַז זענען מאָדעלעד אין אַ סאַלוואַנט מיטל: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A און H2B-HLA-A-HMGA1.אַן ערשט פּראָטעין-פּראָטעין דאַקינג פאַרשטעלן מיט די MOE (מאָלעקולאַר אַפּערייטינג ענוויראָנמענט; כעמישער קאַמפּיוטינג גרופע ינק., מאָנטרעאַל, קוועבעק, קאַנאַדע) פּעקל סאַגדזשעסטיד מעגלעך קאַנפאָרמיישאַנז וואָס זענען אַנדערש צווישן די פּראָטעינס (פיגורע 8 אַ).וויסואַליזאַטיאָן פון די דאַקינג פּראָטעין קאָמפּלעקס אנטפלעקט עטלעכע ינטעראַקשאַנז און מעגלעך קאַנפאָרמיישאַנז (פיגורע 5 אַ, 8).אזוי, איין מעגלעך קאַנפאָרמיישאַן איז געוויזן אין פיגורע 8A (מיט לייבאַלד קרייַז-לינקס) און עס איז געווען ווייַטער עוואַלואַטעד מיט די MD מאָדעלינג רערנ - ליניע.אין דערצו, ביינדינג פון H2B אָדער HMGA1 צו HLA-A כיילייץ די העכער קירבות פון H2B פֿאַר HLA-A (Fig. 8A).
קאָנפאָרמאַטיאָן דינאַמיק פון מעגלעך נעטוואָרקס צווישן די H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A און H2B-HLA-A-HMGA1 קאַמפּלעקסאַז.(א) לינקס טאַפליע איז אַ 2 ד מאַפּע (דזשענערייטאַד אין SIM-XL ווייכווארג) פון ינטראַמאָלעקולאַר (רויט) און ינטערמאָלעקולאַר (בלוי) קראָססלינקס (קראָססלינק קאַטאָף שטעלן צו 3.5).אין אַדישאַן, יידענאַפייד קרייַז-לינקינג רעזאַדוז זענען לייבאַלד אויף די סטראַקטשערז פון די H2B, HLA-A און HMGA1 פּראָטעינס.די פֿאַרבונדן קאַנפאָרמיישאַנז פון די פּראָטעינס זענען יקסטראַקטיד מיט די דאַקינג רערנ - ליניע ימפּלאַמענאַד אין די MOE פּעקל.דער נידעריקער לינקס טאַפליע ווייזט די פאַרשידן מעגלעך קאַנפאָרמיישאַנז פון די H2B-HLA-A און HMGA1-HLA-A קאַמפּלעקסאַז מיט פאַרשידענע פּראָטעין-פּראָטעין ביינדינג אַפיניטיעס (GBVI / WSA dG; kcal / mol).(ב) נאָרמאַל דיווייישאַן (RMSD) פון אַטאָמישע שטעלעס (עקסקלודינג הידראָגען אַטאָמס) פֿאַר יעדער פּראָטעין סטרוקטור.(C) ינטערמאָלעקולאַר פּראָטעין-פּראָטעין הידראָגען בונד ינטעראַקשאַנז פון פאַרשידן סימיאַלייטיד קאַמפּלעקסאַז קאַנסידערינג ספּעציפיש ינטעראַקשאַנז פון געדויער ≥ 10 ns.די ה-בונד מענאַדעוו-אַקסעפּטאָר קאַטאָף דיסטאַנסע איז געווען באַשטימט צו 3.5 Å, און די מענאַדעוו-ה-אַקסעפּטאָר קאַטאָף ווינקל איז געווען באַשטימט צו ≥ 160 °-180 °.(ד) לייבאַלד רעזאַדוז פאָרמינג HLA-A פּראָטעין-פּראָטעין ינטעראַקשאַנז מיט זייער ריספּעקטיוו פּאַרטנערס, ספּאַנינג ≥ 20 ns, יקסטראַקטיד פון דאַמי HLA-A-H2B און HLA-A-HMGA1 קאַמפּלעקסאַז.פּראָטעין סטראַקטשערז פאָרשטעלן אַ דורכשניטלעך סטרוקטור פון 100 ns MDS.(E) ינטעראַקטיאָנס צווישן HLA-A-H2B און HLA-A-HMGA1 קאַמפּלעקסאַז קאַמפּערד מיט ינטעראַקשאַנז טראַקט דורך H2B-HLA סימיאַליישאַן איבער 100 ns באזירט אויף די K אָדער S ינטעראַקשאַן פּלאַץ צווישן די צוויי פּעפּטיידז.קאַמפּלעקסאַז /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.די שוועל ווערט פֿאַר די אפשאצונג פון קרייַז-לינקס איז געווען באַשטימט צו 3.0, און ספּעציפיש ינטעראַקשאַנז פון MDS גענומען ≥ 10 ns זענען גענומען אין חשבון.פּראָטעין סטראַקטשערז זענען וויזשוואַלייזד מיט BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) און מאָלעקולאַר אַפּערייטינג סוויווע (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) פּאַקידזשיז.
די פעסטקייַט פון HLA-A מאַלאַקיולז איבער צייַט (נאָרמאַל דיווייישאַן; RMSD אָדער נאָרמאַל דיווייישאַן; RMSF) ינדיקייץ אַז די בייַזייַן פון H2B אָדער HMGA1 פּראָטעינס אין די קאַמפּלעקסאַז סטייבאַלייזד HLA-A (Figure 8B, Figure S5).די HMGA1 פּראָטעין ביינדז טייטלי צו די B2M פּלאַץ פון HLA-A, ינדוסינג די פעסטקייַט פון די HLA-A אַמינאָ אַסאַדז אין די HLA-A-HMGA1 אָדער H2B-HLA-A-HMGA1 קאָמפּלעקס (פיגורע 8ב, פיגורע ס 5).אין באַזונדער, HLA רעזאַדוז ~ 60-90 און ~ 180-210 זענען געפונען צו זיין ווייניקער פלעקסאַבאַל אין דעם בייַזייַן פון ה 2 ב (FIG. 8 ב).H2B און HMGA1 האָבן געוויזן בעסער ביינדינג צו HLA-A אין די H2B-HLA-A-HMGA1 קאָמפּלעקס קאַמפּערד מיט HLA-A ביינדינג צו H2B אָדער HMGA1 אַליין (פיגורע 8C, D; טיש ס 5).רעזאַדו ינוואַלווד אין הידראָגען באַנדינג (מד מאָדעלעד הויך אַקיאַפּאַנסי ≥ 10 ns) צונויפפאַלן מיט CLMS ינטעראַקשאַן זייטלעך (K אָדער S רעזאַדוז) אין דעם קאָמפּלעקס, סאַגדזשעסטינג אַז די ינטעראַקשאַנז יידענאַפייד דורך CLMS זענען זייער פאַרלאָזלעך.רילייאַבילאַטי (פיג. 8E).אין CLMS און MD מאָדעלינג, HLA-A רעזאַדוז צווישן וועגן 190-210 און וועגן 200-220 אַמינאָ אַסאַדז זענען געפֿונען צו בינדן H2B און HMGA1 ריספּעקטיוולי (FIG. 8E).
פּראָטעין-פּראָטעין ינטעראַקשאַנז פאָרעם דינאַמיש סטראַקטשעראַל נעטוואָרקס וואָס פאַרמיטלען ינטראַסעללולאַר קאָמוניקאַציע אין ענטפער צו זיכער סטימיאַליי.ווייַל פילע פּראָטעאָמיקס אַפּראָוטשיז דעטעקט ענדערונגען אין די קוילעלדיק פעסט שטאַט מדרגה פון אַ פּראָטעין, פּראָטעין-פּראָטעין ינטעראַקשאַן דינאַמיק דאַרפן נאָך מכשירים צו כאַפּן ביינדינג ינטערפייסיז, און CLMS איז אַזאַ אַ געצייַג.די ינטערפעראָן סיגנאַלינג סיסטעם איז אַ סיטאָקינע נעץ וואָס אַלאַוז סעלז צו ריספּאַנד צו אַ קייט פון ינווייראַנמענאַל פּאַטאַדזשעניק און ינטרינסיק פּאַטאַלאַדזשיקאַל סיגנאַלז, קאַלמאַנייטינג אין די ינדאַקשאַן פון סאַבסעץ פון ינטערפעראָן-ינדוסאַבאַל פּראָטעינס.מיר האָבן געווענדט CLMS צו באַשליסן אויב ראָמאַן פּראָטעין-פּראָטעין ינטעראַקשאַנז קען זיין יידענאַפייד צווישן אַ טאַפליע פון ​​ינטערפעראָן-ינדוסט פּראָטעינס.גלאבאלע פּראָטעין קראָס-לינקינג אַנאַליסיס אין אַן ינטערפעראָן-אָפּרופיק פלאָ-1 צעל מאָדעל איז געניצט צו כאַפּן פּראָטעין קאַמפּלעקסאַז.עקסטראַקטיאָן פון טריפּטיק פּעפּטיידז פון ניט-קרייַז-לינגקט און קראָס-לינגקט סעלז אַלאַוז פּעפּטייד קאַונטינג, פּאַטוויי ענריטשמענט און פּעפּטייד לענג פאַרשפּרייטונג מיט דיפיינד LFQ ינטענסיטי.קאַנאָניקאַל ינטערפעראָן-ינדוסאַבאַל פּראָטעינס זענען יידענאַפייד ווי אַ positive ינערלעך קאָנטראָל, בשעת נייַ ינטערמאָלעקולאַר און ינטראַמאָלעקולאַר קראָס-לינגקט אַדדוקץ פון קאַנאַנאַקאַל ינטערפעראָן-ינדוסאַבאַל פּראָטעינס אַזאַ ווי MX1, UP18, OAS3 און STAT1 זענען באמערקט.פאַרשידן סטראַקטשעראַל פֿעיִקייטן און ינטעראַקשאַנז אין פאַנגקשאַנאַל געביטן האָבן שוין ינוועסטאַגייטאַד.
אַ ינטעראַקשאַן צווישן HLA-A, MDN1 און H2B איז דיטעקטאַד דורך ימיונאָבלאָטינג אין Flo-1 און A549 סעלז באהאנדלט און אַנטריטיד מיט IFNα.אונדזער רעזולטאַטן הויכפּונקט אַז HLA-A קאַמפּלעקסאַז מיט H2B אין אַן IFNα-אָפענגיק שטייגער.אונדזער אַרבעט רעפּראַזענץ אַ טשיקאַווע אַוועניו פֿאַר ווייַטער עקספּלעריישאַן פון די קאָ-לאָוקאַלאַזיישאַן פון די צוויי קאַמפּלעקסאַז.עס וואָלט אויך זיין טשיקאַווע צו יקספּאַנד די CLMS צוגאַנג צו אַ טאַפליע פון ​​צעל שורות צו ידענטיפיצירן צעל-טיפּ-פרייַ ינטערפעראָן-מעדיאַטעד פּראָטעין ינטעראַקשאַנז.צום סוף, מיר געוויינט MD מאָדעלינג ווי אַן אָלטערנאַטיוו צוגאַנג צו פֿאַרשטיין די קאַנפאָרמיישאַן דינאַמיק פון פּראָטעינס ינוואַלווד אין די H2BFS-HLA-A-HMGA1 קאָמפּלעקס, וואָס טראַקט ינטראַמאָלעקולאַר און ינטערמאָלעקולאַר קרייַז-טאַלקס.ינפעראַנס פון די CLMS דאַטן פֿאָרשלאָגן די מעגלעכקייט פון פאַרשידענע קאַנפאָרמיישאַנז פון די H2BFS, HLA-A און HMGA1 פּראָטעינס.די מעגלעך פאַרשידענע קאַנפאָרמיישאַנז צווישן די דאַקינג פּראָטעין קאַמפּלעקסאַז אנטפלעקט עטלעכע ינטעראַקשאַנז ענלעך צו די באמערקט אין די CLMS דאַטאַסעט.איינער פון די הויפּט סטרענגקטס פון אונדזער אופֿן איז אַז עס אַלאַוז גרינג לעגיטימאַציע פון ​​ינטעראַקטינג העכסט פּאָלימאָרפיק גענעס אַזאַ ווי HLA, אַזוי עס וועט זיין טשיקאַווע צו לערנען ינטעראַקשאַנז פון HLA האַפּלאָטיפּע-ספּעציפיש פּראָטעינס וואָס זענען אַנדערש שווער צו לערנען.צוזאַמען, אונדזער דאַטן באַווייַזן אַז CLMS קענען זיין גענוצט צו יקספּאַנד אונדזער פארשטאנד פון ינטערפעראָן-ינדוסט סיגנאַלינג נעטוואָרקס און צושטעלן אַ יקער פֿאַר לערנען מער קאָמפּליצירט ינטערסעללולאַר סיסטעמען אין די אָנוווקס מיקראָענוויראָנמענט.
פלאָ-1 סעלז זענען באקומען פון ATCC און מיינטיינד אין DMEM (Gibco) סאַפּלאַמענטאַד מיט 1% פּעניסיללין / סטרעפּטאָמיסין (ינוויטראָגען), 10% פיטאַל באָווין סערום (Gibco) און סטאָרד ביי 37 ° C און 5% CO2.ינגקיוביישאַן.סעלז זענען געוואקסן צו 70-80% קאַנפלואַנס איידער זיי זענען באהאנדלט מיט IFNα14 (מאַניאַפאַקטשערד דורך עדינבורגה פּראָטעין פּראָדוקציע מעכירעס).אַלע אנדערע קעמיקאַלז און רייידזשאַנץ זענען פּערטשאַסט פֿון Sigma Aldrich סייַדן אַנדערש אנגעוויזן.
פלאָ-1 סעלז זענען קאַלטשערד אין 6-געזונט פּלאַטעס און דער ווייַטער טאָג די סעלז זענען באהאנדלט מיט 10 נג / מל IFNα14 פֿאַר 24 שעה צו בעערעך 80% קאַנפלואַנס.סעלז זענען געוואשן דריי מאָל מיט פּבס און ליגייטיד מיט פרעשלי צוגעגרייט דסס (טהערמאָ פישער ססיענטיפיק) (צעלאָזן אין דמסאָ) אין פּבס פֿאַר 5 מינוט בייַ 37 ° סי צו אַ לעצט קאַנסאַנטריישאַן פון 0.5 מם.די דסס קראָססלינקינג אָפּרוף איז ריפּלייסט מיט פּבס און ריזידזשואַל דסס איז קווענטשעד דורך אַדינג 20 מם טריס (pH 8.0) אין פּבס פֿאַר 15 מינוט ביי 37 ° C.סעלז זענען געזאמלט דורך סקרייפּינג און געזאמלט אין נידעריק ביינדינג טובז (אַקסיגן).
דער צעל פּעללעט איז געווען ליסעד מיט 300 μל פון ורעאַ ליסיס באַפער (8 ם ורעאַ, 0.1 ם טריס, pH 8.5) פֿאַר 30 מינוט אין צימער טעמפּעראַטור מיט טיילמאָליק שאַקינג.אַלע סענטריפוגאַטיאָן סטעפּס זענען דורכגעקאָכט ביי 14,000 קג ביי 8 °C.סענטריפיודזש די ליסאַטע פֿאַר 10 מינוט און אַריבערפירן די סופּערנאַטאַנט צו אַ נייַ רער.די רוען קלאָר פּאַרטיקאַלז זענען צעלאָזן אין 150 μל פון די רגע ליסיס באַפער (2 ם ורעאַ, 2% (וו / וו) סדס (סאָדיום דאָדעסיל סאַלפייט)) פֿאַר 30 מינוט אָדער מער ביז אַ כאָומאַדזשיניאַס ייקוויאַס לייזונג איז באקומען.די ליסאַטע איז געווען סענטריפוגעד פֿאַר 20 מינוט און די סופּערנאַטאַנט איז געמישט מיט די ליסאַטע באקומען אין די פריערדיקע שריט.פּראָטעין קאַנסאַנטריישאַנז זענען אַססעססעד מיט די מיקראָ בקאַ אַסיי (טהערמאָ פישער וויסנשאפטלעכע) לויט דער פאַבריקאַנט ס ינסטראַקשאַנז פֿאַר מיקראָפּלאַטע פּראָוסידזשערז.די סאַמפּאַלז זענען געשווינד פאַרפרוירן אין פליסיק ניטראָגען און סטאָרד בייַ -80 ° C.
בעערעך 100 μג פון סאַליאַבאַל קראָס-לינגקט פּראָטעין איז פּראַסעסט מיט אַ מאַדאַפייד פילטריישאַן מוסטער צוגרייטונג פּראָטאָקאָל (FASP) ווי דיסקרייבד דורך Wisniewski et al.69 בעקיצער, דער פּראָטעין איז קראָססלינקעד מיט 200 μל ורעאַ באַפער (8 ם ורעאַ אין 0.1 ם טריס, ף 8.5), וואָרטעקסעד און כאַווד.אַלע סענטריפוגאַטיאָן סטעפּס זענען דורכגעקאָכט ביי 14,000 קג ביי 25 °C.דער ערשטער העלפט פון די קרייַז-לינגקט פּראָטעין ליסאַטע איז טראַנספערד צו אַ 10 kDa מיקראָקאָן סענטריפוגאַל פילטער מיטל יקוויפּט מיט אַ Ultracel-10 מעמבראַנע (Merck), נאכגעגאנגען דורך סענטריפוגאַטיאָן אויף די פילטער פֿאַר 25 מינוט.דעריבער לייגן די רגע העלפט פון די פּראָטעין צו די פילטער און איבערחזרן די זעלבע סטעפּס.פּראָטעין אָפּזוך איז דורכגעקאָכט דורך אַדינג 100 μל פון 17 מם טריס (2-קאַרבאָקסיעטהיל) פאָספינע הידראָטשלאָרידע (טקעפּ) אין ורעאַ באַפער.רעקאָווערי איז סטערד אויף אַ טערמאַמיקסער בייַ 600 רפּם פֿאַר 30 מינוט בייַ 37 ° C.אין אַדישאַן, די זייַל איז געווען סענטריפוגעד און די רידוסט קראָס-לינגקט פּראָטעין איז אַלקילאַטעד מיט 100 μל פון 50 מם יאָדאָאַסעטאַמידע אין ורעאַ באַפער.די אַלקילאַטיאָן אָפּרוף איז געפירט אויס אין צימער טעמפּעראַטור פֿאַר 20 מינוט אין דער פינצטער.דרייען די זייַל, וואַשן די זייַל ווענט 3 מאל מיט 100 μל ורעאַ באַפער, און דעמאָלט סענטריפודזש.דער זעלביקער אָפּעראַציע איז דורכגעקאָכט 3 מאל ניצן 100 μל פון 100 מם אַמאָוניאַם בייקאַרבאָנאַטע.איידער טריפּסיניזאַטיאָן, פאַרבייַטן די זאַמלונג רער מיט אַ נייַע.לייג דיידזשעסטשאַן באַפער מיט 50 מם אַמאָוניאַם בייקאַרבאָנאַטע און 1 μל טריפּסין דיילוטאַד אין טריפּסין באַפער (פּראָמעגאַ).די פאַרהעלטעניש פון טריפּסין צו פּראָטעין איז געווען מיינטיינד בייַ וועגן 1:33, און דיידזשעסטשאַן ריאַקשאַנז זענען ינקובייטיד יבערנאַכטיק בייַ 37 ° סי אין אַ פייַכט קאַמער.די קראָססלינקעד פּעפּטייד איז געווען ילוטאַד פון די פילטער דורך סענטריפוגאַטיאָן פֿאַר 25 מינוט.פּעפּטייד אָפּזוך איז ימפּרוווד דורך אַדינג 50 μל פון 0.5 ם נאַקל צו די פילטער, נאכגעגאנגען דורך סענטריפוגאַטיאָן פֿאַר 25 מינוט.
C18 מיקראָ ספּין שפאלטן (האַרוואַרד אַפּאַראַט) זענען געניצט צו דעסאַלט קרייַז-לינגקט טריפּטיק פּעפּטיידז נאָך דעם פּראָטאָקאָל דיסקרייבד דורך Bouchal et al.70 מיט מינערווערטיק מאָדיפיקאַטיאָנס.בעקיצער, C18 ומדריי שפאלטן זענען אַקטיווייטיד מיט דריי וואַשיז פון 0.1% פאָרמיק זויער (פאַ) אין אַסעטאָניטרילע (אַקן) (מערק) און צוויי וואַשיז פון 0.1% פאַ.דער זייַל איז געווען כיידרייטאַד מיט 0.1% פאַ פֿאַר 15 מינוט.מאַסע סאַמפּאַלז אין ומדריי שפאלטן און וואַשן 3 מאל מיט 0.1% פאַ.די דעסאַלטעד פּעפּטיידז זענען סאַקווענטשאַלי ילוייטיד מיט אַ סטעפּוויסע גראַדיענט ניצן 50%, 80% און 100% AcN אין 0.1% פאַ.די סאַמפּאַלז זענען דאַר אין אַ SpeedVac Plus קאָנסענטראַטאָר (Eppendorf) ביז די ריזידזשואַל פליסיק גאָר פאַרשווונדן.די ילוטיד פּעפּטיידז זענען צעלאָזן אין 100 μל פון 0.08% טריפלואָראָאַסעטיק זויער אין 2.5% AcN און די קאַנסאַנטריישאַנז זענען געמאסטן אויף אַ נאַנאָדראָפּ 2000 (טהערמאָ ססיענטיפיק).בעערעך 1 μג פון קראָססלינקעד פּעפּטייד פּער מוסטער איז ינדזשעקטיד אין די LC-MS / MS סיסטעם.
קראָס-לינגקט פּעפּטיידז זענען אפגעשיידט אויף אַן UltiMate 3000 RSLCnano LC סיסטעם (טערמאָ וויסנשאפטלעכע) קאָננעקטעד צו אַן Orbitrap Exploris 480 מאַסע ספּעקטראָמעטער (טערמאָ ססיענטיפיק).קראָס-לינגקט פּעפּטיידז זענען געזאמלט אויף אַ 300 μm שייַן, 5 מם לאַנג μ-פּרע-זייַל C18 כאַפּן זייַל פּאַקט מיט C18 PepMap100 סאָרבענט און 5 μm PepMap סאָרבענט (טהערמאָ ססיענטיפיק).מאַסע די פּאָמפּע לויפן שטעלן צו 5 μל / מין 0.08% טריפלואָראָאַסעטיק זויער צעלאָזן אין 2.5% אַקן.קרייַז-לינגקט פּעפּטיידז זענען אפגעשיידט אויף אַן אַנאַליטיש פיוזד סיליקאַ זייַל מיט אַ ינער דיאַמעטער פון 75 μם און אַ לענג פון 150 מם, אָנגעפילט מיט אַ 2 μm PepMap סאָרבענט (טערמאָ ססיענטיפיק).רירעוודיק פאַסעס א און ב קאָנסיסטעד פון 0.1% פאַ אין וואַסער און 0.1% פאַ אין אַסאַטאָוניטרילע, ריספּעקטיוולי.דער גראַדיענט סטאַרץ ביי 2.5% ב און ינקריסיז לינעאַרלי צו 40% ב איבער 90 מינוט, דעמאָלט צו 90% ב איבער די ווייַטער 2 מינוט.די רירעוודיק פאַסע זאַץ איז געווען מיינטיינד בייַ 90% ב פֿאַר 10 מינוט און דעמאָלט דיקריסט לינעאַרלי צו 2.5% ב איבער 2 מינוט.דער זייַל איז יקוואַליברייטיד בייַ 2.5% ב פֿאַר 8 מינוט איידער דער ווייַטער ציקל.קראָס-לינגקט פּעפּטיידז ילוייטיד פון די אַנאַליסיס זייַל זענען ייאַנייזד אין אַ נאַנאָעלעקטראָספּרייַ ייאַנאַזיישאַן (NSI) מקור און ינדזשעקטיד אין אַ עקספּלאָריס 480 מאַסע ספּעקטראָמעטער (טהערמאָ ססיענטיפיק).
די Orbitrap Exploris 480 מאַסע ספּעקטראָמעטער אַפּערייטאַד אין די positive דאַטן קאָראַליישאַן מאָדע.א פול יבערקוקן איז דורכגעקאָכט אין אָפּטיילונג מאָדע מיט אַ האַכלאָטע פון ​​120,000 מיט קייט סעטטינגס פון מ / ז 350 טה צו מ / ז 2000 טה.די נאָרמאַלייזד AGC ציל איז געווען באַשטימט צו 300% מיט אַ מאַקסימום אַרייַנשרייַב צייט פון 50ms.מאָנאָיסאָטאָפּיק שפּיץ דיטעקשאַן איז געגרינדעט פֿאַר פּעפּטיידז.די קאַנסטריינץ אָפּרו פּאַראַמעטער איז באַשטימט צו אמת אויב צו ווייניק פּריקערסערז זענען געפֿונען.די מינימום ייאַניק שטאַרקייט פון די פּריקערסער איז געווען באַשטימט צו 5.0e3 און פּריקערסער אָפּצאָל שטאַטן אַרויף צו +8 זענען אַרייַנגערעכנט אין די יקספּעראַמאַנץ.
די ציקל צייט צווישן הויפּט סקאַנז אין דאַטן קאָראַליישאַן מאָדע איז געווען באַשטימט צו 2.5 סעקונדעס.דינאַמיש מאַסע יקסקלוזשאַן איז געווען באַשטימט צו 20 s נאָך דער ערשטער פראַגמאַנטיישאַן פון די פּריקערסער יאָן.די פּריקערסער אפגעזונדערטקייט פֿענצטער איז געווען באַשטימט צו 2 טה.דער טיפּ פון נאָרמאַלייזד צונויפשטויס ענערגיע מיט אַ פאַרפעסטיקט צונויפשטויס ענערגיע מאָדע איז אויסדערוויילט אין אַ דאַטן אָפענגיק MS / MS יבערקוקן.צונויפשטויס ענערגיע שטעלן צו 30%.די אָרביטראַפּ האַכלאָטע איז געווען באַשטימט צו 15,000 און די AGC ציל צו 100%.די מנהג מאַקסימום ינדזשעקשאַן צייט איז באַשטימט צו 60 מיליסעקאַנדז.
איידער טראַקינג די פּראָטעין-פּראָטעין נעץ אין קרייַז-לינגקט סאַמפּאַלז, מיר פּראַסעסט די רוי טעקעס מיט די MaxQuant פּעקל (ווערסיע 1.6.12.0) 26,27 צו ידענטיפיצירן טרייסאַבאַל פּעפּטיידז / פּראָטעינס אין די סאַמפּאַלז.אין אַדישאַן, ענלעך פּראָטעאָמיק אַנאַליזעס זענען דורכגעקאָכט אויף ונקראָססלינגקעד Flo-1 סאַמפּאַלז באהאנדלט און אַנטריטיד מיט IFNα.MS / MS דאַטן זענען געזוכט אין די UniProt מענטש דאַטאַבייס (www.uniprot.org) (ופּלאָאַדעד 12 אויגוסט 2020, כּולל 75,093 איינסן) מיט די געבויט-אין זוכן מאָטאָר Andromeda27.דער זוכן איז דורכגעקאָכט אָן ינדאַקייטינג די ספּעציפֿישקייט פון די ענזיים און פאַרשידן מאָדיפיקאַטיאָנס פון דעאַמידאַטיאָן (N, ק) און אַקסאַדיישאַן (M).פּריקערסער מאַסע טאָלעראַנץ זענען באַשטימט ביי 20 פּיפּיעם און פּראָדוקט ייאַנז ביי 0.02 דאַ.די ערשט און מאַקסימום מאַסע דיווייישאַן איז געווען באַשטימט צו 10 פּיפּיעם.די מאַקסימום מאַסע פון ​​די פּעפּטייד איז געווען באַשטימט ביי 4600 דאַ און די ענלעכקייט פון די סיקוואַנס איז געווען באַשטימט צווישן 7 און 25 אַמינאָ אַסאַדז (אַאַ).ווייַטער סטאַטיסטיש אַנאַליסיס איז דורכגעקאָכט מיט די פּערסעוס פּראָגראַם (ווערסיע 1.6.10.45).פּראָטעין אינהאַלט איז קאַלקיאַלייטיד דורך נאָרמאַלייזינג די ספּעקטראַל ינטענסיטי פון די פּראָטעין (LFQ ינטענסיטי; אַנלייבאַלד קוואַנטאַפאַקיישאַן) 27 און די ינטענסיטי וואַלועס זענען קאָנווערטעד צו Log2.א כייעראַרקאַקאַל קלאַסטערינג פון פּראָטעינס יידענאַפייד דורך זייער פּעפּטייד ינטענסיטי איז געבויט מיט די פעאַטמאַפּ (וו1.0.12) פּעקל אין ר (וו 4.1.2).פּאַטוויי ענריטשמענט אַנאַליסיס איז דורכגעקאָכט מיט די רעאַקטאָמע פּאַטוויי דאַטאַבייס פֿאַר IFNα-באהאנדלט פּראָטעינס וואָס זענען מער ווי פיר מאָל אַקטיווייטיד קאַמפּערד מיט אַנטריטיד סאַמפּאַלז.
לעגיטימאַציע פון ​​ליסינע (ק) אָדער סערינע (ז) ספּעציפיש כעמישער קראָסלינקס פון פּראָטעין קאַמפּלעקסאַז מאָניטאָרעד דורך LC-MS / MS איז דורכגעקאָכט מיט אַ ספּעקטראָסקאָפּיק לעגיטימאַציע מאַשין (SIM-XL) פֿאַר קראָס-לינגקט פּעפּטיידז (SIM-XL)29.ערשטער, מעגלעך ינטעראַקשאַנז צווישן ינטערפעראָן-פֿאַרבונדן (IFN) דנאַ שעדיקן קעגנשטעל כסימע (IRDS) גענעס זענען ינוועסטאַגייטאַד מיט די IRDS פּראָטעין דאַטאַסעט דיסקרייבד אין Padariya et al.28.די זיפּונג פון אַלע באדינגונגען און ריפּיץ פון די גאנצע מענטש UniProt איז קאַמפּיוטישאַנאַלי אינטענסיווע, אַזוי די גאנצע מענטשלעך UniProt דאַטאַבייס (www.uniprot.org) (דאַונלאָודיד 12 אויגוסט 2020, כּולל 75,093 איינסן) קעגן IFNα-באהאנדלט ריפּיץ.איינער פון די פילטערס פֿאַר הויך צוטרוי ינטעראַקשאַנז.די הויך-באַדייט ינטעראַקשאַנז באקומען זענען יקספּאַנדיד און טעסטעד אין אַלע רעפּאַטישאַנז און טנאָים.
אין SIM-XL, DSS איז געניצט פֿאַר די קראָססלינקער (XL) און די XL וואָג יבעררוק און מאָדיפיקאַטיאָן וואָג יבעררוק זענען באַשטימט צו 138.06 און 156.07 ריספּעקטיוולי.די פאלגענדע קראָססלינגקינג אָפּרוף זייטלעך זענען קאַנסידערד: KK, KS און KN-TERM, אָן רעפּאָרטער ייאַנז.ביידע פּריקערסער און פראַגמענט פּפּם זענען באַשטימט צו 20 און די Xrea שוועל איז געווען באַשטימט צו 0.15.טריפּסין איז געהאלטן צו זיין גאָר ספּעציפיש, און אַ הויך-ענערגיע C-טראַפּ (הקד) פראַגמאַנטיישאַן אופֿן איז ימפּלאַמענאַד.די XCorr דינאַמיש דב רעדוקציע שוועל און די מינימום נומער פון פּעפּטיידז פֿאַר דינאַמיש דב רעדוקציע זענען באַשטימט צו 2.5 און 2 ריספּעקטיוולי.אנדערע פּאַראַמעטערס זענען: מאָנאָיסאָטאָפּע מאַשמאָעס און שפּיץ צופאַל קאַטאָף, מינימום 4 אַאַ רעזאַדוז פּער שנירל און מאַקסימום שטראַל אָפּצאָל, און 3 מאַקסימאַ פון מיסט ספּליץ.די ריזאַלטינג סטיטשט 2 ד מאַפּס זענען אַנאַלייזד אין (SIM-XL) און די xQuest28 גראַפיקאַל פאַרטרעטונג איז געניצט צו בויען די 2 ד מאַפּס.פּראָטעין קראָססלינקס אויף פּראָטעין סטראַקטשערז זענען צוגעשטעלט אין PyMol (PyMOL מאָלעקולאַר גראַפיקס סיסטעם, ווערסיע 2.0 Schrödinger, LLC).
פּראָטעין מאָדעל סטראַקטשערז זענען באשאפן מיט די Phyre2 סערווער (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 ניצן די פּרינסאַפּאַלז פון האָמאָלאָגי מאָדעלינג און ימפּלאַמענטיישאַן פון די "פאַרבאָרגן מאַרקאָוו מעטאַד".Phyre2 דזשענערייץ מאָדעל סטראַקטשערז באזירט אויף סיקוואַנס אַליינמאַנט מיט באַוווסט פּראָטעין סטראַקטשערז.פֿאַר H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 און MDN1 פּראָטעינס, מוסטער סטראַקטשערז 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 און 6i2665 זענען געניצט.אין אַדישאַן, די סטרוקטור פון AlphaFold71 MX1, UBP18 און ROBO1 איז אויך קאַנסידערד.די פּראָטעין סטרוקטור איז וויזשוואַלייזד מיט די BIOVIA Discovery Studio Visualizer פּעקל (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) און די מאָלעקולאַר אַפּערייטינג סוויווע פּעקל (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).