דאנק איר פֿאַר באזוכן Nature.com.איר נוצן אַ בלעטערער ווערסיע מיט לימיטעד CSS שטיצן.פֿאַר דער בעסטער דערפאַרונג, מיר רעקאָמענדירן אַז איר נוצן אַ דערהייַנטיקט בלעטערער (אָדער דיסייבאַל קאַמפּאַטאַבילאַטי מאָדע אין Internet Explorer).אין אַדישאַן, צו ענשור אָנגאָינג שטיצן, מיר ווייַזן דעם פּלאַץ אָן סטיילז און דזשאַוואַסקריפּט.
סלידערס וואָס ווייַזן דריי אַרטיקלען פּער רוק.ניצן די צוריק און ווייַטער קנעפּלעך צו מאַך דורך די סליידז, אָדער די רוק קאָנטראָללער קנעפּלעך אין די סוף צו מאַך דורך יעדער רוק.
347 ומבאַפלעקט שטאָל רער באַשרייַבונג
347 12.7 * 1.24 מם ומבאַפלעקט שטאָל קוילד טובינג
אַרויס דיאַמעטער: 6.00 מם אָד אַרויף צו 914.4 מם אָד, סיזעס אַרויף צו 24 "נב בנימצא עקס-לאַגער, OD גרייס שטאָל טובז בנימצא עקס-לאַגער
SS 347 רער גרעב קייט: 0.3 מם - 50 מם, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, עטק (0.5-12 מם) אָדער ניט-רעגולער גרייס צו זיין טיילערד ווי פארלאנגט
טיפּ: סס 347 סימלאַס פּייפּס |SS 347 ERW פּייפּס |סס 347 וועלדעד פּייפּס |סס 347 פאַבריקייטיד פּייפּס |SS 347 CDW טובז, LSAW פּייפּס / נעט-וועלדעד / רידראַון
פאָרעם: סס 347 ראָונד פּייפּס / טובז, סס 347 קוואדראט פּייפּס / טובז, סס 347 רעקטאַנגגיאַלער רער / טובז, סס 347 קוילד טובז, סס 347 "ו" פאָרעם, סס 347 פּאַן שטיקל קוילז, סס 347 הידראַוליק טובז
לענג: איין טראַפ, טאָפּל טראַפ & פארלאנגט לענג סוף: קלאָר סוף, בעוועלעד סוף, טרעדיד
סוף שוץ: פּלאַסטיק קאַפּס |אַרויס ענדיקן: 2B, No.4, No.1, No.8 שפּיגל ענדיקן פֿאַר ומבאַפלעקט שטאָל פּייפּס, ענדיקן ווי פּער קונה רעקווירעמענץ
עקספּרעס צושטאַנד: אַניילד און זויער, פּאַלישט, העל אַניאַלד, קאַלט ציען
דורכקוק, טעסט רעפּאָרץ: מיל טעסט סערטיפיקאַץ, EN 10204 3.1, כעמישער רעפּאָרץ, מעטשאַניקאַל רעפּאָרץ, PMI טעסט רעפּאָרץ, וויסואַל דורכקוק רעפּאָרץ, דריט טיילווייַז דורכקוק רעפּאָרץ, NABL באוויליקט לאַב רעפּאָרץ, דעסטרוקטיווע טעסט באריכט, נאָן דעסטרוקטיווע טעסט רעפּאָרץ
פּאַקינג: פּאַקט אין וואָאָדען באָקסעס, פּלאַסטיק באַגס, שטאָל סטריפּס באַנדאַלד אָדער לויט קאַסטאַמערז ריקוועס
ספּעסיאַליז: סיזעס און ספּעסאַפאַקיישאַנז אנדערע ווי אויבן קענען זיין מאַניאַפאַקטשערד אויף בעטן
SS 347 רער גרייס קייט: 1/2 אינטש NB, OD צו 24 אינטש
ASTM A312 347: סימלאַס און גלייַך-נעט וועלדעד אַוסטעניטיק רער בדעה פֿאַר הויך טעמפּעראַטור און אַלגעמיין קעראָוסיוו דינסט.פיללער מעטאַל איז נישט דערלויבט בעשאַס וועלדינג.
ASTM A358 347: עלעקטריק פוסיאָן וועלדעד אַוסטעניטיק רער פֿאַר קעראָוסיוו און / אָדער הויך טעמפּעראַטור דינסט.טיפּיקאַללי בלויז רער אַרויף צו 8 אינטש איז געשאפן צו דעם באַשרייַבונג.דערצו פון פיללער מעטאַל איז דערלויבט בעשאַס וועלדינג.
ASTM A790 347: סימלאַס און גלייַך-נעט וועלדעד פערריטיק / אַוסטעניטיק (דופּלעקס) רער בדעה פֿאַר גענעראַל קעראָוסיוו דינסט, מיט אַ באַזונדער טראָפּ אויף קעגנשטעל צו דרוק קעראָוזשאַן קראַקינג.
ASTM A409 347: גלייַך-נעט אָדער ספּיראַליש-נעט עלעקטריק פוסיאָן וועלדעד אַוסטעניטיק ליכט וואַנט רער מיט גרויס דיאַמעטער אין סיזעס 14 "צו 30" מיט ווענט Sch5S און Sch 10S פֿאַר קעראָוסיוו און / אָדער הויך
ASTM A376 347: סימלאַס אַוסטעניטיק רער פֿאַר הויך טעמפּעראַטור אַפּלאַקיישאַנז.
ASTM A813 347: איין-נעט, איין אָדער טאָפּל וועלדעד אַוסטעניטיק רער פֿאַר הויך טעמפּעראַטור און אַלגעמיין קעראָוסיוו אַפּלאַקיישאַנז.
ASTM A814 347: קאַלט-געארבעט וועלדעד אַוסטעניטיק רער פֿאַר הויך טעמפּעראַטור און אַלגעמיין קעראָוסיוו דינסט.
347 ה ומבאַפלעקט שטאָל פּייפּס כעמישער זאַץ
| גראַדע | C | Mn | Si | P | S | Cr | Mo | Ni | N | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 347H | מין. | 0.04 | — | — | — | — | 17.0 | 3.00 | 9.0 | — |
| מאַקס. | 0.10 | 2.0 | 1.00 | 0.045 | 0.030 | 19.0 | 4.00 | 13.0 | — | |
ומבאַפלעקט שטאָל 347 ה רער מעטשאַניקאַל פּראָפּערטיעס
| גראַדע | טענסאַל סטרענגטה (מפּאַ) מין | Yield Strength 0.2% פּרוף (מפּאַ) מין | ילאָנגגיישאַן (% אין 50 מם) מין | כאַרדנאַס | |
|---|---|---|---|---|---|
| Max Rockwell B (HR B) | ברינעלל (הב) מאַקס | ||||
| 347H | 515 | 205 | 40 | 92 | 201 |
ומבאַפלעקט שטאָל 347 ה פּייפּס גשמיות פּראָפּערטיעס
| גראַדע | געדיכטקייַט (קג/מ3) | עלאַסטיק מאָדולוס (GPa) | מיטל קאָואַפישאַנט פון טערמאַל יקספּאַנשאַן (מ/מ/0C) | טערמאַל קאַנדאַקטיוואַטי (וו/מק) | ספּעציפיש היץ 0-1000C (J/kg.K) | עלעקטריקאַל רעסיסטיוויטי (נם) | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0-1000C | 0-3150C | 0-5380C | בייַ 1000C | בייַ 5000C | |||||
| 347H | 8000 | 193 | 17.2 | 17.8 | 18.4 | 16.2 | 21.5 | 500 | 720 |
עקוויוואַלענט גראַדעס פֿאַר 347 ה ומבאַפלעקט שטאָל רער
| גראַדע | UNS No | אַלטע בריטיש | Euronorm | שוועדיש סס | יאַפּאַניש דזשיס | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| BS | En | No | נאָמען | ||||
| 347H | S34709 | — | — | 1.4961 | — | — | — |
| סטאַנדאַרדס | באַצייכענונג |
| ASTM | א 312 |
|---|---|
| ASME | SA 312 |
אַמילאָיד אַלף-סינוקלעין (αS) אַגגרעגאַטיאָן איז אַ כאַלמאַרק פון פּאַרקינסאָן ס קרענק און אנדערע סינוקלינאָפּאַטהיעס.לעצטנס, די טאַו פּראָטעין קאַמאַנלי פֿאַרבונדן מיט אַלזשעימער ס קרענק איז געווען פֿאַרבונדן מיט αS פּאַטאַלאַדזשי און געפֿונען צו קאָו-לאָוקאַלייזד אין αS-רייַך ינקלוזשאַנז, כאָטש די מאָלעקולאַר מעקאַניזאַם פון קאָאַגגאַגיישאַן פון די צוויי פּראָטעינס בלייבט ומקלאָר.מיר באַריכט דאָ אַז די αS פאַסע סעפּערייץ אין פליסיק קאַנדאַנסייץ דורך ילעקטראָוסטאַטיק קאָמפּלעקס קאַנדאַנסיישאַן מיט דורכויס באפוילן פּאָליפּעפּטיידז אַזאַ ווי טאַו.דעפּענדינג אויף די אַפיניטי פון αS פֿאַר פּאָליקאַטיאָנס און די קורס פון וואַלאַנס דיפּלישאַן פון די קאָואַגיאַליישאַן נעץ, קלאַץ אַנדערגאָו גיך געלאַטיאָן אָדער קאָואַלעססענסע נאכגעגאנגען דורך פּאַמעלעך אַמילאָיד אַגגרעגאַטיאָן.דורך קאַמביינינג אַ סוויט פון אַוואַנסירטע ביאָפיסיקאַל טעקניקס, מיר זענען ביכולת צו קעראַקטערייז די פליסיק-פליסיק αS / Tau פאַסע צעשיידונג און ידענטיפיצירן די שליסל סיבות וואָס פירן צו די פאָרמירונג פון כעטעראַדזשיניאַס אַגגרעגאַץ מיט ביידע פּראָטעינס אין אַ פליסיק פּראָטעין קאַנדאַנסייט.
אין אַדישאַן צו מעמבראַנע קאַמפּאַרטמאַנץ, ספּיישאַל צעשיידונג אין סעלז קענען אויך זיין אַטשיווד דורך די פאָרמירונג פון פּראָטעין-רייַך, פליסיק-ווי געדיכט ללבער גערופֿן בייאָומאָלעקולאַר קאַנדאַנסייץ אָדער דראַפּלאַץ, דורך אַ פּראָצעס באקאנט ווי פליסיק-פליסיק פאַסע צעשיידונג (LLPS).די דראַפּלאַץ זענען געשאפן דורך מאַלטיוואַלאַנט טעמפּעראַל ינטעראַקשאַנז, יוזשאַוואַלי צווישן פּראָטעינס אָדער פּראָטעינס און רנאַ, און דינען אַ פאַרשיידנקייַט פון פאַנגקשאַנז אין כּמעט אַלע לעבעדיק סיסטעמען.א גרויס נומער פון LLP-טויגעוודיק פּראָטעינס ויסשטעלונג סיקוואַנסיז פון נידעריק קאַמפּלעקסיטי וואָס זענען העכסט דיסאָרדערד אין נאַטור און אין די פאָרמירונג פון בייאָומאָלעקולאַר קאַנדאַנסייץ 3,4,5.פילע יקספּערמענאַל שטודיום האָבן אנטפלעקט די פלעקסאַבאַל, אָפט דיסאָרדערד און מולטיוואַלענט נאַטור פון די פּראָטעינס וואָס מאַכן די פליסיק-ווי קאַנדאַנסייץ, כאָטש קליין איז באַוווסט וועגן די ספּעציפיש מאָלעקולאַר דיטערמאַנאַנץ וואָס קאָנטראָלירן דעם וווּקס און מאַטשוריישאַן פון די קאַנדאַנסייץ צו אַ מער האַרט-ווי. שטאַט..
די נייַע דאַטן שטיצן די כייפּאַטאַסאַס אַז אַבעראַנט פּראָטעין-געטריבן LLPS און טראַנספאָרמאַציע פון דראַפּלאַץ אין האַרט סטראַקטשערז קען זיין באַטייַטיק סעליאַלער פּאַטווייז וואָס פירן צו די פאָרמירונג פון ינסאַליאַבאַל טאַקסיק אַגגרעגאַץ וואָס זענען אָפט כאַלמאַרקס פון דידזשענעראַטיוו חולאתן.פילע LLPS-פארבונדן ינטרינסיקאַללי דיסאָרדערד פּראָטעינס (ידפּס), אָפט העכסט באפוילן און פלעקסאַבאַל, האָבן לאַנג שוין פֿאַרבונדן מיט נעוראָדעגענעראַטיאָן דורך דעם פּראָצעס פון אַמילאָיד אַגגרעגאַטיאָן.אין באַזונדער, בייאָומאָלעקולאַר IDP קאַנדאַנסייץ אַזאַ ווי FUS7 אָדער TDP-438 אָדער פּראָטעינס מיט גרויס נידעריק קאַמפּלעקסיטי דאָומיינז אַזאַ ווי hnRNPA19 האָבן שוין געוויזן צו עלטער אין געל-ווי אָדער אפילו האַרט פארמען דורך אַ פּראָצעס גערופֿן פלוידיזאַטיאָן.קאַמפּאַונד.צו האַרט פאַסע יבערגאַנג (LSPT) ווי אַ פונקציע פון צייט אָדער אין ענטפער צו זיכער פּאָסט-טראַנסליישאַנאַל מאָדיפיקאַטיאָנס אָדער פּאַטאַלאַדזשיקאַללי באַטייַטיק מיוטיישאַנז1,7.
אן אנדער IDP פֿאַרבונדן מיט LLPS אין וויוואָו איז טאַו, אַ מיקראָטובולע-פֿאַרבונדן דיסאָרדערד פּראָטעין וועמענס אַמילאָיד אַגגרעגאַטיאָן איז געווען ימפּלאַקייטיד אין אַלזשעימער ס קרענק 10 אָבער איז אויך לעצטנס ימפּלאַקייטיד אין פּאַרקינסאָן ס קרענק (פּד) און אנדערע סינאַפּטיק יאָדער פּראָטעינאָפּאַטהיעס 11, 12, 13 זענען שייַכות.טאַו איז געוויזן צו ספּאַנטייניאַסלי דיססאָסיאַטע פון לייזונג / סיטאָפּלאַסם רעכט צו גינציק ילעקטראָוסטאַטיק ינטעראַקשאַנז14, ריזאַלטינג אין די פאָרמירונג פון טאַו-ענריטשט דראַפּלאַץ באקאנט ווי ילעקטראָוסטאַטיק קאָאַסערוואַטעס.עס איז אויך באמערקט אַז דעם טיפּ פון ניט-ספּעציפיש ינטעראַקשאַן איז די דרייווינג קראַפט הינטער פילע בייאָומאָלעקולאַר קאַנדאַנסייץ אין נאַטור15.אין דעם פאַל פון אַ טאַו פּראָטעין, ילעקטראָוסטאַטיק אַגגרעגאַטיאָן קענען זיין געשאפן דורך פּשוט אַגגרעגאַטיאָן, אין וואָס פאַרקערט באפוילן מקומות פון דעם פּראָטעין צינגל די קלעאַוואַגע פּראָצעס, אָדער דורך קאָמפּלעקס אַגגרעגאַטיאָן דורך ינטעראַקשאַן מיט נעגאַטיוולי טשאַרדזשד פּאָלימערס אַזאַ ווי רנאַ.
לעצטנס, α-synuclein (αS), אַן אַמילאָיד IDP ימפּלאַקייטיד אין פּד און אנדערע נעוראָדעגענעראַטיווע חולאתן קאַלעקטיוולי באקאנט ווי סינוקלעינאָפּאַטהי17,18, איז דעמאַנסטרייטיד אין סעליאַלער און כייַע מאָדעלס 19,20 קאַנסאַנטרייטאַד אין פּראָטעין קאַנדאַנסייץ מיט פליסיק-ווי נאַטור.אין וויטראָ שטודיום האָבן געוויזן אַז αS אַנדערגאָוז LLPS דורך פּשוט אַגגרעגאַטיאָן דורך פּרידאַמאַנאַנטלי כיידראָופאָביק ינטעראַקשאַנז, כאָטש דעם פּראָצעס ריקווייערז יקסעפּשנאַלי הויך פּראָטעין קאַנסאַנטריישאַנז און ייטיפּיקאַללי לאַנג ינגקיוביישאַן צייט 19,21.צי די αS-מיט קאַנדאַנסייץ באמערקט אין וויוואָו זענען געשאפן דורך דעם אָדער אנדערע LLPS פּראַסעסאַז בלייבט אַ שליסל אַנריזאַלווד אַרויסגעבן.סימילאַרלי, כאָטש αS אַמילאָיד אַגגרעגאַטיאָן איז באמערקט אין נוראַנז אין פּד און אנדערע סינוקלינאָפּאַטהיעס, די פּינטלעך מעקאַניזאַם דורך וואָס αS אַנדערגאָוז ינטראַסעללולאַר אַמילאָיד אַגגרעגאַטיאָן בלייבט ומקלאָר, ווייַל אָוווערעקספּרעססיאָן פון דעם פּראָטעין קען נישט ויסמיידן דעם פּראָצעס דורך זיך.נאָך סעליאַלער שעדיקן איז אָפט פארלאנגט, סאַגדזשעסטינג אַז זיכער סעליאַלער לאָוקיישאַנז אָדער מיקראָענוויראָנמענץ זענען פארלאנגט פֿאַר די רענוקלעאַטיאָן פון ינטראַסעללולאַר αS אַמילאָיד אַסעמבליז.איין סעליאַלער סוויווע וואָס איז דער הויפּט פּראָנע צו אַגגרעגאַטיאָן קען זיין די ינלענדיש פון פּראָטעין קאַנדאַנסייץ 23 .
ינטערעסטינגלי, αS און טאַו האָבן שוין געפֿונען צו קאָ-לאָוקאַלייזד אין כאַראַקטעריסטיש קרענק ינקלוזשאַנז אין יומאַנז מיט פּאַרקינסאָן ס קרענק און אנדערע סינוקלעינאָפּאַטהיעס 24,25 און יקספּעראַמאַנץ האָבן געמאלדן אַ סינערדזשיסטיק פּאַטאַלאַדזשיקאַל שייכות צווישן די צוויי פּראָטעינס 26,27 סאַגדזשעסטינג אַ פּאָטענציעל שייכות צווישן אַגגרעגאַטיאָן αS און טאַו אין נעוראָדעגענעראַטיווע חולאתן.קראנקהייט.αS און טאַו האָבן שוין געפֿונען צו ינטעראַקט און העכערן יעדער אנדערע ס אַגגרעגאַטיאָן אין וויטראָ און אין וויוואָו 28,29 און העטעראַדזשיניאַס אַגגרעגאַץ קאַמפּאָוזד פון די צוויי פּראָטעינס זענען באמערקט אין די סייכל פון פּאַטיענץ מיט סינוקלעינאָפּאַטהיעס 30.אָבער, קליין איז באַוווסט וועגן די מאָלעקולאַר יקער פון די ינטעראַקשאַן צווישן αS און טאַו און די מעקאַניזאַם פון זייַן קאָ-אַגגאַגיישאַן.αS איז רעפּאָרטעד צו ינטעראַקט מיט טאַו דורך אַן ילעקטראָוסטאַטיק אַטראַקשאַן צווישן די העכסט נעגאַטיוולי טשאַרדזשינג C-וואָקזאַל געגנט פון αS און די הויפט פּראָלינע-רייַך געגנט פון טאַו, וואָס איז אויך ענריטשט אין דורכויס טשאַרדזשינג רעזאַדוז.
אין דעם לערנען, מיר ווייַזן אַז αS קענען טאַקע דיססאָסיאַטע אין דראַפּלאַץ דורך ילעקטראָוסטאַטיק קאָמפּלעקס קאַנדאַנסיישאַן אין דעם בייַזייַן פון טאַו פּראָטעין, אין קאַנטראַסט צו זייַן ינטעראַקשאַן מיט אנדערע דורכויס טשאַרדזשינג פּאָליפּעפּטיידז אַזאַ ווי פּאָלי-ל-ליסין (פּלק), און אין דעם פּראָצעס.αS אקטן ווי אַ סקאַפאַלד מאַלאַקיול פֿאַר די דראָפּלעט נעץ.מיר האָבן יידענאַפייד באמערקט דיפעראַנסיז אין דעם פּראָצעס פון מאַטשוריישאַן פון ילעקטראָוסטאַטיק αS קאָאַסערוואַטעס, וואָס זענען פארבונדן מיט דיפעראַנסיז אין די וואַלאַנסי און שטאַרקייט פון די ינטעראַקשאַן פון פּראָטעינס ינוואַלווד אין די קאָאַסערוואַט נעץ.ינטערעסטינגלי, מיר באמערקט קאָ-אַגאַגיישאַן פון αS און טאַו אַמילאָיד פּראָטעינס אין לאַנג-געלעבט פליסיק קאָאַסערוואַץ און יידענאַפייד עטלעכע שליסל סיבות וואָס פירן צו קאָ-אַגגאַגיישאַן פון די צוויי פּראָטעינס אין אַזאַ קאָאַסערוואַץ.דאָ מיר באַשרייַבן אין דעטאַל דעם פּראָצעס, וואָס איז אַ מעגלעך מאָלעקולאַר מעקאַניזאַם אַנדערלייינג די קאָלאָקאַליזאַטיאָן פון צוויי פּראָטעינס אין קרענק-ספּעציפיש ינקלוזשאַנז.
αS האט אַ העכסט אַניאָניק C-וואָקזאַל עק ביי נייטראַל ף (Fig. 1 אַ), און מיר כייפּאַטאַסייזד אַז עס קען אַנדערגאָו LLPS דורך די קאַנדאַנסיישאַן פון ילעקטראָוסטאַטיק קאַמפּלעקסאַז מיט פּאָליקאַטיאָניק דיסאָרדערד פּאָליפּעפּטידע מאַלאַקיולז.מיר געוויינט אַ 100-רעזיד פּאָלי-ל-ליסין (פּלק) ווי די סטאַרטינג מאָדעל מאַלאַקיול רעכט צו זיין דורכויס-טשאַרדזשד און דיסאָרדערד פּאָלימעריק נאַטור ביי נייטראַל ף 32. ערשטער, מיר באשטעטיקט אַז פּלק ינטעראַקץ מיט די קט פעלד פון αS דורך לייזונג נמר ספּעקטראָסקאָפּי (פיגורע 1ב) ניצן 13C/15N-לייבאַלד αS אין דעם בייַזייַן פון ינקריסינג αS:pLK מאָלאַר ריישיאָוז.די ינטעראַקשאַן פון pLK מיט די Ct- פעלד פון αS מאַנאַפעסץ זיך אין פּערטערביישאַנז פון די כעמישער יבעררוק און אַ פאַרקלענערן אין די שפּיץ ינטענסיטי אין דעם געגנט פון דעם פּראָטעין.ינטערעסטינגלי, ווען מיר געמישט αS מיט pLK אין אַ αS קאַנסאַנטריישאַן פון אַפּפּראָקס.5-25 μM אין דעם בייַזייַן פון פּאַליעטאַלין גלייקאָל (5-15% PEG-8) (טיפּיש LLPS באַפער: 10 mm HEPES pH 7.4, 100 mm NaCl, 15% PEG-8) מיר מיד דורכגעגאנגען אַ ברייט פעלד פון פּראָטעין פאָרמירונג .דראַפּלאַץ זענען באמערקט ניצן פלורעסאַנס (ווף) און העל-פעלד (בף) מיקראָסקאָפּי (פיגורע 1 ק).1-5 μm דראַפּלאַץ מיט קאַנסאַנטרייטאַד αS (צוגעלייגט 1 μM AlexaFluor488-labeled αS, AF488-αS), זייער ילעקטראָוסטאַטיק פּראָפּערטיעס קענען זיין דערייווד פון זייער קעגנשטעל צו 10% 1,6-העקסאַנדיאָל (1,6-HD) און זייַן סענסיטיוויטי צו אַ פאַרגרעסערן אין נאַקל קאַנסאַנטריישאַן (Fig. 1c).די פליסיק-ווי נאַטור פון די קאָאַסערוואַטעס פון די αS / pLK ילעקטראָוסטאַטיק קאָמפּלעקס איז דעמאַנסטרייטיד דורך זייער פיייקייט צו פוסע אין מיליסעקאַנדז (Fig. 1d).ניצן טורבידימעטרי, מיר קוואַנטאַפייד די פאָרמירונג פון דראַפּלאַץ אונטער די באדינגונגען, באשטעטיקט די ילעקטראָוסטאַטיק נאַטור פון די הויפּט ינטעראַקשאַן פֿאַרבונדן מיט זייַן פעסטקייַט (Fig. 1e), און עוואַלואַטעד די ווירקונג פון פאַרשידן פּאָלימער ריישיאָוז אויף די LLPS פּראָצעס (Fig. 1f).כאָטש דראָפּלעט פאָרמירונג איז באמערקט איבער אַ ברייט קייט פון פּאָלימער ריישיאָוז, דער פּראָצעס איז זייער גינציק ווען pLK איז מער ווי αS.LLPs זענען אויך באמערקט מיט די כעמיש אַנדערש דיספּלייסינג אַגענט דעקסטראַן-70 (70 kDa) אָדער ניצן אַ פאַרשיידנקייַט פון מוסטער פֿאָרמאַטירונגען, אַרייַנגערעכנט גלאז רוק טראפנס, מיקראָפּלאַטע וועלז פון פאַרשידן מאַטעריאַלס, Eppendorf אָדער קוואַרץ קאַפּאַלעריז.
אַ סכעמאַטיש פאַרטרעטונג פון פאַרשידענע פּראָטעין מקומות אין די WT-αS און ΔCt-αS וועריאַנץ געניצט אין דעם לערנען.די אַמפיפּאַטהיק N-וואָקזאַל פעלד, די הידראָפאָביק אַמילאָיד-פאָרמינג (NAC) געגנט, און די נעגאַטיוו טשאַרדזשינג C-וואָקזאַל פעלד זענען געוויזן אין בלוי, מאַראַנץ און רויט ריספּעקטיוולי.די נעץ אָפּצאָל פּער רעזידענטשאַל (NCPR) מאַפּע פון WT-αS איז געוויזן.b NMR אַנאַליסיס פון די αS / pLK ינטעראַקשאַן אין דער אַוועק פון מאַקראָמאָלעקולאַר קלאַמפּס.ווען פּלק קאַנסאַנטריישאַן ינקריסיז (αS:pLK מאָלאַר ריישיאָוז פון 1:0.5, 1:1.5 און 1:10 זענען געוויזן אין ליכט גרין, גרין און טונקל גרין ריספּעקטיוולי).c קאָאַסערוואַט αS/pLK (מאָלאַר פאַרהעלטעניש 1:10) ביי 25 μM (1 μM AF488-לייבאַלד αS אָדער Atto647N-labeled pLK פֿאַר WF ימאַגינג) אין LLPS באַפער (שפּיץ) אָדער סאַפּלאַמענטאַד מיט 500 מם NaCl (דנאָ לינקס) אָדער נאָך 10 % 1,6-העקסאַנדיאָל (1,6-הד; דנאָ רעכט).וואָג באַר = 20 μם.ד רעפּרעסענטאַטיווע מיקראָסקאָפּיק בילדער פון בף דראַפּלאַט פוסיאָן פון αS / pLK (מאָלאַר פאַרהעלטעניש 1:10) אין אַ קאַנסאַנטריישאַן פון 25 μם;אַראָוז אָנווייַזן די מערדזשינג פון יחיד טראפנס (רויט און געל אַראָוז) אין אַ נייַ קאַפּ (מאַראַנץ פייַל) ין 200 מיז).וואָג באַר = 20 μם.e ליכט צעוואָרפן (ביי 350 נם) αS / pLK אַגגרעגאַטיאָן אין LLPS באַפער איידער און נאָך אַדישאַן פון 500 מם NaCl אָדער 10% 1,6-HD ביי 25 μM αS (N = 3 מוסטער רעפּלאַקאַז, מיטל און נאָרמאַל דיווייישאַן אויך אנגעוויזן).f BF בילד (שפּיץ) און ליכט צעוואָרפן אַנאַליסיס (ביי 350 נם, דנאָ) פון αS / pLK אַגגרעגאַטיאָן ביי 25 μM αS מיט ינקריסינג αS: pLK מאָלאַר פאַרהעלטעניש (N = 3 מוסטער רעפּלאַקייטן, מיטל און נאָרמאַל דיווייישאַן אויך אנגעוויזן).וואָג באַר = 10 μם.די וואָג באַר אויף איין בילד ינדיקייץ די וואָג פון אַלע בילדער אין איין טאַפליע.רוי דאַטן זענען צוגעשטעלט אין די פאָרעם פון רוי דאַטן טעקעס.
באַזירט אויף אונדזער אַבזערוויישאַנז פון αS / pLK ילעקטראָוסטאַטיק קאָמפּלעקס קאַנדאַנסיישאַן און פרייַערדיק אַבזערוויישאַנז פון αS ווי אַ קליענט מאַלאַקיול פון די טאַו / רנאַ קאַנדאַנסייט דורך דירעקט ינטעראַקשאַן מיט טאַו31, מיר כייפּאַטאַסייזד אַז αS און טאַו קען זיין סעגרעגאַטעד מיט די סאַלוואַנט אין דער אַוועק פון רנאַ. קאַנדאַנסיישאַן.דורך ילעקטראָוסטאַטיק קאַמפּלעקסאַז, און αS איז די סקאַפאַלד פּראָטעין אין αS / Tau קאָאַסערוואַטעס (זען טאַו אָפּצאָל פאַרשפּרייטונג אין פיגורע 2e).מיר באמערקט אַז ווען 10 μM αS און 10 μM Tau441 (מיט 1 μM AF488-αS און 1 μM Atto647N-Tau, ריספּעקטיוולי) זענען געמישט צוזאַמען אין LLPS באַפער, זיי לייכט געשאפן פּראָטעין אַגגרעגאַץ מיט ביידע פּראָטעינס, ווי געזען דורך WF מיקראָסקאָפּי.(פיג. 2 אַ).די קאָלאָקאַליזאַטיאָן פון די צוויי פּראָטעינס אין די דראַפּלאַץ איז באשטעטיקט דורך קאַנפאָקאַל (קף) מיקראָסקאָפּי (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 1 אַ).ענלעכע נאַטור איז באמערקט ווען דעקסטראַן-70 איז געניצט ווי אַ אַגגרעגאַטיאָן אַגענט (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 1 ק).ניצן אָדער FITC-לייבאַלד PEG אָדער דעקסטראַן, מיר געפונען אַז ביידע קראַודינג אגענטן זענען יוואַנלי פונאנדערגעטיילט איבער די סאַמפּאַלז, ווייַזונג ניט סעגרעגאַציע אדער פאַרבאַנד (סופּפּלעמענטאַרי פייג. קסנומקסד).אלא, עס סאַגדזשעסץ אַז אין דעם סיסטעם זיי העכערן פאַסע צעשיידונג דורך מאַקראָמאָלעקולאַר קראַוד יפעקץ, ווייַל PEG איז אַ פּרעפערענטשאַלי סטאַביל קראַודינג אַגענט, ווי געזען אין אנדערע LLP סיסטעמען33,34.די פּראָטעין-רייַך דראַפּלאַץ זענען שפּירעוודיק צו נאַקל (1 ב) אָבער נישט צו 1,6-הד (10% וו / וו), קאַנפערמינג זייער ילעקטראָוסטאַטיק פּראָפּערטיעס (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 2 אַ, ב).זייער פליסיק אָפּפירונג איז באשטעטיקט דורך אַבזערווינג מיליסעקאַנד מערדזשינג דראָפּלעט געשעענישן ניצן BF מיקראָסקאָפּי (Fig. 2b).
אַ קאָנפאָקאַל (קף) מיקראָסקאָפּי בילדער פון αS / Tau441 קאָאַסערוואַץ אין LLPS באַפער (10 μM פון יעדער פּראָטעין, 0.5 μM פון AF488-לייבאַלד αS און Atto647N-לייבאַלד טאַו441).ב רעפּריזענאַטיוו דיפערענטשאַל ינטערפיראַנס קאַנטראַסט (DIC) בילדער פון αS / Tau441 דראַפּלאַט פוסיאָן געשעענישן (10 μם פֿאַר יעדער פּראָטעין).c פאַסע דיאַגראַמע באזירט אויף ליכט צעוואָרפן (ביי 350 נם) פון Tau441 LLPS (0-15 μM) אין דער אַוועק (לינקס) אָדער בייַזייַן (רעכט) פון 50 μM αS.וואָרמער פארבן אָנווייַזן מער צעוואָרפן.ד ליכט צעוואָרפן פון αS / Tau441 LLPS סאַמפּאַלז מיט ינקריסינג αS קאַנסאַנטריישאַן (Tau441 ביי 5 μM, N = 2-3 מוסטער רעפּאַטישאַנז ווי אנגעוויזן).e סכעמאַטיש פאַרטרעטונג פון עטלעכע טאַו פּראָטעין וועריאַנץ און פאַרשידענע רעגיאָנס פון די פּראָטעין געניצט אין דעם לערנען: נעגאַטיוו טשאַרדזשינג N-וואָקזאַל פעלד (רויט), פּראָלינע-רייַך געגנט (בלוי), מיקראָטובולע-ביינדינג פעלד (מטבד, כיילייטיד אין מאַראַנץ), און אַמילאָיד-פאָרמינג פּאָר ספּיראַליש.פאָדעם מקומות (PHF) ליגן אין די MTBD (גרוי).די נעץ אָפּצאָל פּער רעזאַדו (NCPR) מאַפּע פון Tau441 איז געוויזן.f ניצן 1 ΔM AF488-לייבאַלד αS און Atto647N-לייבאַלד ΔNt-, ניצן 1 ΔM AF488-לייבאַלד αS אָדער ΔCt-αS אין דעם בייַזייַן פון ΔNt-Tau (שפּיץ, 10 μM פּער פּראָטעין) אָדער K150 (דנאָ פּראָטעין) ) ) ) מיקראָגראַפס פון WF קאַנדענסט אין LLPS אָדער K18 באַפער.די וואָג באַרס אין איין בילד רעפּראַזענץ די וואָג פון אַלע בילדער אין איין טאַפליע (20 μם פֿאַר פּאַנאַלז אַ, ב און F).רוי דאַטן פֿאַר פּאַנאַלז C און D זענען צוגעשטעלט ווי רוי דאַטן טעקעס.
צו פּרובירן די ראָלע פון αS אין דעם LLPS פּראָצעס, מיר ערשטער ינוועסטאַגייטאַד די ווירקונג פון αS אויף דראָפּלעט פעסטקייַט דורך נעפעלאָמעטרי ניצן ינקריסינג קאַנסאַנטריישאַנז פון NaCl (Fig. 2c).די העכער די זאַלץ קאַנסאַנטריישאַן אין די סאַמפּאַלז מיט αS, די העכער די ליכט צעוואָרפן וואַלועס (ביי 350 nm), וואָס ינדיקייץ די סטייבאַלייזינג ראָלע פון αS אין דעם LLPS סיסטעם.א ענלעך ווירקונג קענען זיין באמערקט דורך ינקריסינג די αS קאַנסאַנטריישאַן (און דערפאר די αS:Tau441 פאַרהעלטעניש) צו בעערעך.10-פאַרלייגן פאַרגרעסערן קאָרעוו צו די טאַו קאַנסאַנטריישאַן (5 μM) (Fig. 2 ד).צו באַווייַזן אַז αS איז אַ סקאַפאַלד פּראָטעין אין קאָאַסערוואַטעס, מיר באַשלאָסן צו פאָרשן די נאַטור פון די LLPS-דיסראַפּטיד טאַו מוטאַנט, וואָס פעלן אַ נעגאַטיוולי טשאַרדזשינג ען-וואָקזאַל געגנט (רעזאַדז 1-150, זען Fig. 2e) גערופן ΔNT-Tau.WF מיקראָסקאָפּי און נעפעלאָמעטרי באשטעטיקט אַז ΔNT-Tau זיך האט נישט אַנדערגאָו LLPS (Fig. 2f און Supplementary Fig. 2d), ווי פריער געמאלדן 14. אָבער, ווען αS איז געווען צוגעגעבן צו דיספּערסיאָן סאַלושאַנז פון דעם טראַנגקייטיד טאַו וואַריאַנט, די LLPS פּראָצעס איז געווען גאָר. געזונט מיט דראַפּלאַט געדיכטקייַט נאָענט צו די דראַפּלאַט געדיכטקייַט פון פול-גרייס סאַלושאַנז פון טאַו און αS אונטער ענלעך טנאָים און פּראָטעין קאַנסאַנטריישאַנז.דעם פּראָצעס קענען אויך זיין באמערקט אונטער טנאָים פון נידעריק מאַקראָמאָלעקולאַר קראַוד (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 2ק).די ראָלע פון די C-וואָקזאַל αS געגנט, אָבער נישט די גאנצע לענג, אין די LLPS פּראָצעס איז דעמאַנסטרייטיד דורך ינאַבישאַן פון דראַפּלאַט פאָרמירונג ניצן אַ C-וואָקזאַל טראַנגקייטיד αS וואַריאַנט פעלנדיק רעזאַדוז 104-140 (Fig. 1 אַ) פון די (ΔCt- αS) פּראָטעין (Fig. 2f און סאַפּלאַמענערי Fig. 2d).די קאָלאָקאַליזאַטיאָן פון αS און Δנט-טאַו איז באשטעטיקט דורך קאַנפאָקאַל פלורעסאַנס מיקראָסקאָפּי (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 1ב).
צו ווייַטער פּרובירן די LLPS מעקאַניזאַם צווישן Tau441 און αS, אַן נאָך טאַו וואַריאַנט איז געניצט, ניימלי די פּערד כעליקאַל פאָדעם האַרץ (PHF) פראַגמענט אין די מיקראָטובולע-ביינדינג פעלד (MTBD), וואָס אויב עס כּולל פיר כאַראַקטעריסטיש איבערחזרן דאָומיינז, קאַמאַנלי אויך באקאנט ווי די ק18 פראַגמענט (זען Fig. 2e).עס איז לעצטנס געמאלדן אַז αS פּרעפערענטשאַלי ביינדז צו אַ טאַו פּראָטעין לאָוקייטאַד אין אַ פּראָלינע-רייַך פעלד אין אַ סיקוואַנס וואָס פּריסידז די מיקראָטובולע-ביינדינג פעלד.אָבער, די PHF געגנט איז אויך רייַך אין דורכויס באפוילן רעזאַדוז (זען פיגורע 2e), ספּעציעל ליסין (15% רעזאַדוז), וואָס פּראַמפּטיד אונדז צו פּרובירן צי דעם געגנט אויך קאַנטריביוץ צו די קאַנדאַנסיישאַן פון די αS / Tau קאָמפּלעקס.מיר באמערקט אַז K18 אַליין קען נישט צינגל LLPS אין קאַנסאַנטריישאַנז אַרויף צו 100 μם אונטער די טעסטעד טנאָים (LLPS באַפער מיט 15% PEG אָדער 20% דעקסטראַן) (פיגורע 2f).אָבער, ווען מיר צוגעגעבן 50 μM αS צו 50 μM K18, גיך פאָרמירונג פון פּראָטעין דראַפּלאַץ מיט K18 און αS איז באמערקט דורך נעפעלאָמעטרי (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 2 ד) און WF מיקראָסקאָפּי (Fig. 2f).ווי דערוואַרט, ΔCt-αS קען נישט ומקערן די LLPS נאַטור פון ק18 (Fig. 2f).מיר טאָן אַז αS/K18 אַגגרעגאַטיאָן ריקווייערז אַ ביסל העכער פּראָטעין קאַנסאַנטריישאַנז צו ינדוסירן LLPS קאַמפּערד מיט αS/ΔNt-Tau אָדער αS/Tau441, אנדערע זאכן זענען גלייַך.דאָס איז קאָנסיסטענט מיט אַ שטארקער ינטעראַקשאַן פון די αS C-וואָקזאַל געגנט מיט די פּראָלינע-רייַך טאַו פעלד קאַמפּערד מיט די מיקראָטובולע-ביינדינג פעלד, ווי דיסקרייבד פריער 31.
געגעבן אַז ΔNt-Tau קענען נישט דורכפירן LLPS אין דער אַוועק פון αS, מיר אויסדערוויילט דעם טאַו וואַריאַנט ווי אַ מאָדעל פֿאַר קעראַקטערייזינג αS / Tau LLPS ווייַל פון זיין פּאַשטעס אין LLPS סיסטעמען מיט פול-לענג טאַו (יסאָטיפּע, Tau441 / Tau441).מיט קאָמפּלעקס (העטעראָטיפּיק, αS/Tau441) אַגגרעגאַטיאָן פּראַסעסאַז.מיר קאַמפּערד די גראַד פון αS אַגגרעגאַטיאָן (ווי אַ טייל פון די קאַנדענסט פאַסע פּראָטעין, fαS,c) אין די αS/Tau און αS/ΔNt-Tau סיסטעמען דורך סענטריפוגאַטיאָן און דיספּערסט פאַסע SDS-PAGE אַנאַליסיס (זען 2e), געפֿונען זייער ענלעך וואַלועס. פֿאַר אַלע פּראָטעינס אין דער זעלביקער קאַנסאַנטריישאַן.אין באַזונדער, מיר באקומען fαS, c 84 ± 2% און 79 ± 7% פֿאַר αS/Tau און αS/ΔNT-Tau, ריספּעקטיוולי, סאַגדזשעסטינג אַז די העטעראָטיפּיק ינטעראַקשאַן צווישן αS און טאַו איז העכער ווי די ינטעראַקשאַן צווישן טאַו מאַלאַקיולז.צווישן.
די ינטעראַקשאַן מיט פאַרשידן פּאָליקאַטיאָנס און די ווירקונג פון די קאַנדאַנסיישאַן פּראָצעס אויף די αS קינעטיק איז געווען ערשטער געלערנט דורך די פלואָרעססענסע אָפּזוך נאָך פאָטאָבלעאַטשינג (FRAP) אופֿן.מיר טעסטעד αS/Tau441, αS/ΔNT-Tau און αS/pLK קאָאַסערוואַטעס (100 μM αS סאַפּלאַמענטאַד מיט 2μM αS AF488-αS און 100μM Tau441 אָדער ΔNT-Tau אָדער 1 מם פּלק).דאַטן זענען באקומען אין דער ערשטער 30 מינוט נאָך מיקסינג די מוסטער קאַמפּאָונאַנץ.פֿון רעפּריזענאַטיוו FRAP בילדער (Fig. 3a, αS/Tau441 קאַנדאַנסיישאַן) און זייער קאָראַספּאַנדינג צייט קורס קורוועס (Fig. 3b, Supplementary Fig. 3), עס קענען זיין געזען אַז αS קינעטיק איז זייער ענלעך צו די פון טאַו441 קאָאַסערוואַטעס.און ΔNt-Tau, וואָס איז פיל פאַסטער מיט פּלק.די קאַלקיאַלייטיד דיפיוזשאַן קאָואַפישאַנץ פֿאַר αS ין די קאָאַסערוואַט לויט FRAP (ווי דיסקרייבד דורך Kang et al. 35) זענען D = 0.013 ± 0.009 μm2/s און D = 0.026 ± 0.008 μm2/s פֿאַר αS/Tau441 און αS/Tau441 די αS/ סיסטעם.פּלק, טאַו, און ד = 0.18 ± 0.04 μמ2/s, ריספּעקטיוולי (Fig. 3c).אָבער, די דיפיוזשאַן קאָואַפישאַנט αS אין די דיספּערסט פאַסע איז עטלעכע אָרדערס פון מאַגנאַטוד העכער ווי אַלע קאַנדענסט פייזאַז, ווי באשלאסן דורך פלואָרעססענסע קאָרעלאַטיאָן ספּעקטראָסקאָפּי (פקס, זען סאַפּלאַמענערי פייג. 3) אונטער די זעלבע באדינגונגען (LLPS באַפער) אָבער אין דער אַוועק פון פּאָליקאַטיאָנס (ד = 8 ± 4 μמ2/s).דעריבער, די קינעטיק פון αS איבערזעצונג איז באטייטיק רידוסט אין קאָאַסערוואַטעס קאַמפּערד מיט פּראָטעינס אין די דיספּערסט פאַסע רעכט צו פּראַנאַונסט מאָלעקולאַר קראַוד יפעקץ, כאָטש אַלע קאָאַסערוואַטעס ריטיין פליסיק-ווי פּראָפּערטיעס אין דער ערשטער האַלב שעה נאָך זייער פאָרמירונג, אין קאַנטראַסט צו די טאַו פאַסע.פאַסטער קינעטיק אין pLK קאַנדאַנסייט.
אַ–C FRAP אַנאַליסיס פון αS דינאַמיק (2% AF488-לייבאַלד αS) אין ילעקטראָוסטאַטיק קאָאַסערוואַץ.רעפּריזענאַטיוו בילדער פון αS / Tau441 FRAP אַסייז אין טריפּליקאַט זענען געוויזן אין (אַ), ווו רויט קרייזן אָנווייַזן דעקאָלאָריזעד געביטן.די וואָג באַר איז 5 μם.ב דורכשניטלעך FRAP קורוועס און (C) קאַלקיאַלייטיד דיפיוזשאַן קאָואַפישאַנץ (ד) פֿאַר 5-6 (N) פאַרשידענע דראַפּלאַץ פון דריי יקספּעראַמאַנץ ניצן 100 μM αS און עקווימאָלאַר קאַנסאַנטריישאַנז פון Tau441 (רויט) אָדער ΔNt-Tau (בלוי) אָדער פּלק (גרין) אין צען מאל די קאַנסאַנטריישאַן פון LLPS.דער נאָרמאַל דיווייישאַן פון די FRAP ויסבייג איז געוויזן אין שיידיד קאָליר.פֿאַר פאַרגלייַך, די דיפיוזשאַן קאָואַפישאַנט αS אין די דיספּערסט פאַסע איז באשלאסן אין טריפּליקאַט מיט פלואָרעססענסע קאָראַליישאַן ספּעקטראַסקאָפּי (FCS) (זען סאַפּלאַמענערי פיגור 3 און מעטהאָדס פֿאַר מער אינפֿאָרמאַציע).ד קעסיידערדיק X-באַנד EPR ספּעקטראַ פון 100 μM TEMPOL-122-αS אין LLPS באַפער אָן קיין פּאָליקאַטיאָן (שוואַרץ) אָדער אין דעם בייַזייַן פון 100 μM Tau441 (רויט) אָדער ΔNt-Tau (בלוי) אָדער 1 מם פּלק (גרין).דער ינסעט ווייזט אַ מאַגנאַפייד מיינונג פון די שטאַרק פעלד שורות ווו די מערסט דראַמאַטיק ענדערונגען פאַלן.E ביינדינג קורוועס פון 50 μM TEMPOL-122-αS מיט פאַרשידן פּאָליקיישאַנז אין דער אַוועק פון LLPS (קיין קרוק).די רידוסט אַמפּליטוד פון באַנד III קאַמפּערד מיט באַנד II (III / III) פון די נאָרמאַלייזד EPR ספּעקטרום איז געוויזן צו פאַרגרעסערן די מאָלאַר ריישיאָוז פון Tau441 (רויט), ΔNt-Tau (בלוי) און pLK (גרין).בונט שורות ווייַזן פּאַסיק צו דאַטן ניצן אַ פּראָסט ביינדינג מאָדעל מיט n יידעניקאַל און פרייַ ביינדינג זייטלעך אויף יעדער ויסבייג.רוי דאַטן זענען צוגעשטעלט אין די פאָרעם פון רוי דאַטן טעקעס.
ווי אַ דערגאַנג, מיר ינוועסטאַגייטאַד די דינאַמיק פון αS אין פאַרשידן קאָאַסערוואַץ ניצן דירעקטעד ספּין לייבלינג (SDSL) און קעסיידערדיק עלעקטראָן פּאַראַמאַגנעטיק רעזאַנאַנס (CW-EPR).דער אופֿן איז פּראָווען צו זיין זייער נוציק אין ריפּאָרטינג די בייגיקייט און דינאַמיק פון די IDP מיט אַ רעאַליסטיש ריזידזשואַל האַכלאָטע 36,37,38.צו דעם סוף, מיר קאַנסטראַקטאַד סיסטינע רעזאַדו אין איין סיס מיוטאַנץ און געוויינט די 4-כיידראָקסי-2,2,6,6-טעטראַמעטהילפּיפּערידינע-ען-אָקסיל (TEMPOL) ספּין זאָנד.Maleimide דעריוואַטיווז שטעלן זיי.מער ספּאַסיפיקלי, מיר ינסערטאַד TEMPOL פּראָבעס אין שטעלע 122 אָדער 24 αS (TEMPOL-122-αS און TEMPOL-24-αS).אין דער ערשטער פאַל, מיר צילן די C-וואָקזאַל געגנט פון דעם פּראָטעין, וואָס איז ינוואַלווד אין ינטעראַקשאַן מיט פּאָליקאַטיאָנס.אַנשטאָט, שטעלע 24 קענען געבן אונדז אינפֿאָרמאַציע וועגן די קוילעלדיק דינאַמיק פון פּראָטעינס אין די קאַנדאַנסייט.אין ביידע קאַסעס, די EPR סיגנאַלז באקומען פֿאַר פּראָטעינס פון די דיספּערסט פאַסע קאָראַספּאַנדיד צו ניטראָקסידע ראַדאַקאַלז אין די שנעל מאָווינג שטאַט.נאָך פאַסע צעשיידונג אין דעם בייַזייַן פון טאַו אָדער pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 אָדער ΔNt-Tau אין אַ פאַרהעלטעניש פון 1:1 אָדער pLK אין אַ פאַרהעלטעניש פון 1:10), אַ פאַרגרעסערן אין די קאָרעוו שפּיץ ינטענסיטי איז באמערקט אין די EPR ספּעקטרום פון αS.די אָנווער שורה בראָדאַנד, ינדאַקייטינג רידוסט αS ריאָריענטאַטיאָן קינעטיק אין דראַפּלאַץ קאַמפּערד צו פּראָטעין אין צעפירן פאַסע (Fig. 3d, Supplementary Fig. 4a).די ענדערונגען זענען מער פּראַנאַונסט אין שטעלע 122. בשעת אין שטעלע 24 די בייַזייַן פון פּלק האט נישט ווירקן די קינעטיק פון די זאָנד, אין שטעלע 122 די ספּעקטראַל שורה פאָרעם געביטן באטייטיק (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 4 אַ).ווען מיר געפרוווט צו מאָדעל די ספּעקטראַ אין שטעלע 122 פון צוויי αS / פּאָליקאַטיאָן סיסטעמען ניצן די יסאָטראָפּיק מאָדעל (סופּפּלעמענטאַרי פיגור 5 אַ) קאַמאַנלי געניצט צו באַשרייַבן די דינאַמיק פון ספּין-לייבאַלד IDP38,39, מיר זענען נישט ביכולת צו רעקאָנסטרוירן די יקספּערמענאַל ספּעקטראַ..ספּעקטראַל סימיאַליישאַן פון די שטעלע פון 24 ספּינז קאַנטראַס (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 5 אַ).דאָס סאַגדזשעסץ אַז עס זענען פּרעפערענטשאַל שטעלעס אין דעם פּלאַץ פון ומדריי קאַנפיגיעריישאַנז פון די C-וואָקזאַל געגנט פון αS אין דעם בייַזייַן פון פּאָליקאַטיאָנס.ווען קאַנסידערינג די בראָכצאָל פון αS אין די קאַנדענסט פאַסע אונטער יקספּערמענאַל EPR טנאָים (84 ± 2%, 79 ± 7% און 47 ± 4% פֿאַר αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, און αS/pLK, ריספּעקטיוולי - זען סאַפּלאַמענטערי פיג. αS), און נישט פּראָטעין קאַנדאַנסיישאַן.אַ פאַרגרעסערן אין מיקראָוויסקאָסיטי איז באמערקט אין די זאָנד.ווי דערוואַרט, די EPR ספּעקטרום פון די פּראָטעין אונטער באדינגונגען אנדערע ווי LLPS איז גאָר געזונט ווען קסנומקס ם נאַקל איז מוסיף צו די געמיש (סופּפּלעמענטאַרי פייג. קסנומקס ב).קוילעלדיק, אונדזער דאַטן פֿאָרשלאָגן אַז די ענדערונגען דיטעקטאַד דורך CW-EPR דער הויפּט פאַרטראַכטנ די ינטעראַקשאַן פון די C-וואָקזאַל געגנט פון αS מיט פאַרשידן פּאָליקאַטיאָנס אין די קאַנדענסט פאַסע, און די ינטעראַקשאַן איז שטארקער מיט pLK ווי מיט Tau.
אין סדר צו באַקומען מער סטראַקטשעראַל אינפֿאָרמאַציע וועגן די פּראָטעינס אין די קאָאַסערוואַט, מיר באַשלאָסן צו לערנען די LLPS סיסטעם ניצן NMR אין לייזונג.אָבער, מיר קען בלויז דעטעקט די αS בראָכצאָל וואָס איז רוען אין די דיספּערסט פאַסע, וואָס קען זיין רעכט צו רידוסט פּראָטעין דינאַמיק ין די קאָאַסערוואַט און אַ געדיכט פאַסע אין די דנאָ פון די לייזונג אין NMR אַנאַליסיס.ווען מיר אַנאַלייזד די סטרוקטור און דינאַמיק פון די פּראָטעין רוען אין די דיספּערסט פאַסע פון די LLPS מוסטער ניצן נמר (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 5c, d), מיר באמערקט אַז דער פּראָטעין ביכייווד כּמעט יידעניקאַל אין דעם בייַזייַן פון pLK און ΔNt-Tau, ביידע פון וואָס זענען געווען אין צווייטיק סטרוקטור און דינאַמיק פון די פּראָטעין באַקבאָון, גילוי דורך יקספּעראַמאַנץ אויף צווייטיק כעמישער יבעררוק און R1ρ אָפּרו.NMR דאַטן ווייַזן אַז די C-טערמינוס פון αS סאַפערז אַ באַטייטיק אָנווער פון קאַנפאָרמאַטיאָנאַל בייגיקייַט בשעת ריטיינינג זייַן דיסאָרדערד נאַטור, ווי די רעשט פון די פּראָטעין סיקוואַנס, רעכט צו זיין ינטעראַקשאַנז מיט פּאָליקיישאַנז.
זינט די בראָדאַן פון CW-EPR סיגנאַל אין די TEMPOL-122-αS קאַנדענסט פאַסע ריפלעקס די ינטעראַקשאַן פון פּראָטעין מיט פּאָליקיישאַנז, מיר דורכגעקאָכט אַן EPR טיטריישאַן צו אָפּשאַצן די ביינדינג קירבות פון αS צו פאַרשידן פּאָליקיישאַנז אין דער אַוועק פון LLPS (קיין אַקיומיאַליישאַן פון Buffer LLPS), סאַגדזשעסטינג אַז די ינטעראַקשאַנז זענען די זעלבע אין צעפירן און קאַנסאַנטרייטאַד פייזאַז (וואָס איז באשטעטיקט דורך אונדזער דאַטן, סופּפּלעמענטאַרי פייג. 4 אַ און סאַפּלאַמענערי פייג. 6).דער ציל איז געווען צו זען אויב אַלע קאָאַסערוואַטעס, טראָץ זייער פּראָסט פליסיק-ווי פּראָפּערטיעס, ויסשטעלונג קיין אַנדערלייינג דיפערענטשאַל נאַטור אויף די מאָלעקולאַר מדרגה.ווי דערוואַרט, די EPR ספּעקטרום בראָדאַנד מיט ינקריסינג פּאָליקאַטיאָן קאַנסאַנטריישאַן, ריפלעקטינג אַ פאַרקלענערן אין מאָלעקולאַר בייגיקייַט רעכט צו מאָלעקולאַר ינטעראַקשאַנז פון אַלע ינטעראַקשאַן פּאַרטנערס כּמעט צו זעטיקונג (Fig. 3e, Supplementary Fig. 6).pLK אַטשיווד דעם זעטיקונג אין אַ נידעריקער מאָלאַר פאַרהעלטעניש (פּאָליקאַטיאָן: αS) קאַמפּערד מיט ΔNt-Tau און Tau441.אין פאַקט, פאַרגלייַך פון די דאַטן מיט אַן דערנענטערנ ביינדינג מאָדעל אַסומינג n יידעניקאַל און פרייַ ביינדינג זייטלעך געוויזן אַז די קלאָר דיססאָסיאַטיאָן קעסיידערדיק פון pLK (~ 5 μM) איז אַ סדר פון מאַגנאַטוד נידעריקער ווי אַז פון Tau441 אָדער ΔNt-Tau (~ 50 μM) ).µM).כאָטש דאָס איז אַ פּראָסט אָפּשאַצונג, דאָס סאַגדזשעסץ אַז αS האט אַ העכער קירבות פֿאַר סימפּלער פּאָליקאַטיאָנס מיט קעסיידערדיק positive אָפּצאָל מקומות.געגעבן דעם חילוק אין קירבות צווישן αS און פאַרשידן פּאָליקאַטיאָנס, מיר כייפּאַטאַסייזד אַז זייער פליסיק פּראָפּערטיעס קען טוישן דיפערענטלי איבער צייַט און אַזוי ליידן פון פאַרשידענע LSPT פּראַסעסאַז.
געגעבן די העכסט ענג סוויווע אין די פּראָטעין קאָאַסערוואַט און די אַמילאָיד נאַטור פון די פּראָטעין, מיר באמערקט די נאַטור פון די קאָאַסערוואַט איבער צייַט צו דעטעקט מעגלעך LSPT פּראַסעסאַז.מיט BF און CF מיקראָסקאָפּי (פיגורע 4), מיר באמערקט אַז αS / Tau441 קאָאַסערוויץ אין אַ גרויס מאָס אין לייזונג, פאָרמינג גרויס דראַפּלאַץ וואָס קאָנטאַקט און נאַס די ייבערפלאַך אין די דנאָ פון די געזונט / רוק ווי פול דראַפּלאַץ, ווי דערוואַרט (סופּפּלעמענטאַרי פייג). .7ד);מיר רופן די דנאָ-געגרינדעט סטראַקטשערז "פּראָטעין ראַפץ".די סטראַקטשערז פארבליבן פליסיק ווי זיי ריטיינד די פיייקייט צו פיוס (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 7 ב) און קען זיין געזען פֿאַר עטלעכע שעה נאָך LLPS איז טריגערד (Fig. 4 און סאַפּלאַמענערי פייג. 7 ק).מיר באמערקט אַז די וועטינג פּראָצעס איז פייווערד אויף די ייבערפלאַך פון כיידראָופיליק אלא ווי כיידראָופאָביק מאַטעריאַלס (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 7 אַ), ווי דערוואַרט פֿאַר ילעקטראָוסטאַטיק קאָאַסערוואַטעס מיט אַנבאַלאַנסט טשאַרדזשיז און אַזוי הויך ילעקטראָוסטאַטיק ייבערפלאַך פּאָטענציעל.נאָוטאַבלי, αS / ΔNT-Tau קאָואַלעסאַנס און ראַפטינג זענען באטייטיק רידוסט, בשעת αS / pLK קאַנדאַנסייץ זענען באטייטיק רידוסט (Fig. 4).בעשאַס די קורץ ינגקיוביישאַן צייט, די αS / pLK דראַפּלאַץ זענען ביכולת צו קאָואַלעסס און נאַס די כיידראָופיליק ייבערפלאַך, אָבער דעם פּראָצעס געשווינד סטאַפּט און נאָך 5 שעה פון ינגקיוביישאַן, בלויז לימיטעד קאָואַלעסאַנס געשעענישן און קיין וועטינג זענען באמערקט.- געל-דריפּן יבערגאַנג.
פארשטייער BF (גרייסקאַלע פּאַנאַלז) און CF (רעכט פּאַנאַלז, AF488-לייבאַלד αS אין גרין) פון קאָאַסערוואַט סאַמפּאַלז מיט 100 μM αS (1% פלורעסאַנט פירמע) אין LLPS באַפער אין דעם בייַזייַן פון 100 μM Tau441 (שפּיץ) פלואָרעססענסע בילדער ΔN) -טאַו (צענטער) אָדער 1 מם פּלק (דנאָ) אין פאַרשידענע ינגקיוביישאַן צייט און פאָקאַל כייץ (ז, דיסטאַנסע פון די דנאָ פון די טעלער געזונט).די יקספּעראַמאַנץ זענען ריפּיטיד 4-6 מאל ינדיפּענדאַנטלי פון יעדער אנדערער מיט די זעלבע רעזולטאַטן.αS/Tau441 קאָאַסערוואַטעס זענען וועטיד נאָך 24 שעה, פאָרמינג ראַפץ גרעסער ווי די בילד.די וואָג באַר פֿאַר אַלע בילדער איז 20 μם.
דערנאָך מיר געפרעגט צי די גרויס פליסיק-ווי פּראָטעין פּאָאָלס געשאפן אין αS / Tau441 LLPS וואָלט פירן צו אַמילאָיד אַגגרעגאַטיאָן פון קיין פון די פּראָטעינס געלערנט.מיר נאכגעגאנגען די מאַטשוריישאַן פון αS / Tau441 דראַפּלאַץ איבער צייַט מיט WF מיקראָסקאָפּי אונטער די זעלבע באדינגונגען ווי אויבן, אָבער ניצן 1 μM AF488-לייבאַלד αS און Atto647N-labeled Tau441 (Fig. 5 אַ).ווי דערוואַרט, מיר באמערקט גאַנץ פּראָטעין לאָוקאַלאַזיישאַן איבער די מאַטשוריישאַן פּראָצעס.ינטערעסטינגלי, פון קאַ.נאָך 5 שעה, מער טיף ניט-קייַלעכיק סטראַקטשערז זענען באמערקט ין די ראַפץ, וואָס מיר גערופן "פּוינט", עטלעכע פון וואָס זענען קאָלאָקאַליזעד מיט αS, און עטלעכע זענען ענריטשט אין טאַו441 (פיג. 5 אַ, ווייַס אַראָוז).די ספּאַץ האָבן שטענדיק געווען באמערקט אין ראַפץ אין אַ גרעסערע מאָס פֿאַר αS/ΔNT-Tau ווי פֿאַר αS/ΔNT-Tau.עס זענען געווען קיין בוילעט ספּאַץ אין די דראַפּלאַץ פון פּלק און טאַו סיסטעמען ינקאַמפּאַטאַנט פֿאַר פוסיאָן / וועטינג.צו פּרובירן צי די סטאַינס מיט αS און Tau441 זענען אַמילאָיד-ווי אַגגרעגאַץ, מיר דורכגעקאָכט אַ ענלעך עקספּערימענט מיט CF מיקראָסקאָפּי אין וואָס Tau441 איז געווען לייבאַלד מיט Atto647N און 12.5 μM אַמילאָיד-ספּעציפיש טהיאָפלאַווין-ט (טהט) איז צוגעגעבן פון די אָנהייב.פאַרב.כאָטש טה-סטיינינג פון αS/Tau441 דראַפּלאַץ אָדער ראַפץ איז נישט באמערקט אפילו נאָך 24 ה פון ינגקיוביישאַן (פיג. 5ב, שפּיץ רודערן - רוען דראַפּלאַץ איבער פּראָטעין ראַפץ), טהט-positive סטראַקטשערז מיט Atto647N-Tau441 ין די ראַפץ זענען זייער שוואַך.דאָס רעפּליקייץ די גרייס, פאָרעם און אָרט פון די פריער דיסקרייבד ספּאַץ (פיגורע 5ב, מיטל און דנאָ ראָוז), סאַגדזשעסטינג אַז די ספּאַץ קען שטימען צו אַמילאָיד-ווי אַגגרעגאַץ געשאפן אין יידזשינג פליסיק קאָאַסערוואַץ.
WF 25 μM αS אין פאַרשידן ינגקיוביישאַן צייט און פאָקאַל כייץ (ז, דיסטאַנסע פון אַנבאַונד דנאָ) אין דעם בייַזייַן פון 25 μM Tau441 (1 μM AF488-labeled αS און Atto647N-labeled Tau441) אין אַ געזונט פון אַ מיקראָסקאָפּ טעלער מיט LLPS באַפער) .זעקס יקספּעראַמאַנץ זענען ינדיפּענדאַנטלי ריפּיטיד מיט ענלעך רעזולטאַטן.ב CF מיקראָסקאָפּיק בילד פון 25 μM αS אין דעם בייַזייַן פון 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-labeled Tau441) און 12.5 μM Thioflavin-T (ThT).ווייטעד פּראָטעין דראַפּלאַץ און דאַפּאַזיטיד פּראָטעין ראַפץ און ספּאַץ זענען געוויזן אין די שפּיץ און מיטן ראָוז, ריספּעקטיוולי.די דנאָ רודערן ווייזט בילדער פון ראַפץ און טראפנס פון 3 פרייַ רעפּלאַקאַז.ווייַס אַראָוז אָנווייַזן טהט-positive דאַץ אין ביידע פּאַנאַלז.די וואָג באַר פֿאַר אַלע בילדער איז 20 μם.
צו ונטערזוכן אין מער דעטאַל די ענדערונגען אין די קאָאַסערוואַט פּראָטעין נעץ בעשאַס די יבערגאַנג פון פליסיק צו האַרט, מיר געוויינט פלואָרעססענסע לעבן ימאַגינג (FLIM) און Förster רעזאַנאַנס ענערגיע אַריבערפירן מיקראָסקאָפּי (FRET) (פיגורע 6 און סאַפּלאַמענערי פיגיערז 8 און 9).מיר כייפּאַטאַסייזד אַז די קאָאַסערוואַט מאַטשוריישאַן פון די שיכטע אין אַ מער קאַנדענסט אָדער אפילו האַרט-ווי אַגגרעגאַטעד פּראָטעין סטרוקטור פירט צו נעענטער קאָנטאַקט צווישן די פּראָטעין און די פלורעסאַנט זאָנד אַטאַטשט צו עס, פּאַטענטשאַלי פּראַדוסינג אַ קווענטשינג ווירקונג ארויסגעוויזן אין אַ פאַרקירצט זאָנד לעבן (τ) , ווי דיסקרייבד פריער40.,41 ,42.אין אַדישאַן, פֿאַר טאָפּל-לייבאַלד סאַמפּאַלז (AF488 און Atto647N ווי FRET מענאַדעוו און אַקסעפּטאָר דיעס ריספּעקטיוולי), די פאַרקלענערן אין τ קענען אויך זיין באגלייט דורך קאָאַסערוואַט קאַנדאַנסיישאַן און אַ פאַרגרעסערן אין FRET (E) עפעקטיווקייַט בעשאַס LSPT.מיר מאָניטאָרעד פּליט און אָרט פאָרמירונג איבער צייט אין LLPS αS/Tau441 און αS/ΔNT-Tau סאַמפּאַלז (25 ΔM פון יעדער פּראָטעין אין LLPS באַפער מיט 1 ΔM AF488 מיטן נאָמען αS און / אָדער Atto647N מיטן נאָמען Tau441 אָדער ΔNt-Tau).מיר באמערקט אַ גענעראַל גאַנג אין אַז די פלואָרעססענסע לעבן פון די AF488 (τ488) און Atto647N (τ647N) פּראָבעס דיקריסט אַ ביסל ווי די קאָאַסערוואַטעס מאַטיורד (Fig. 6 און סאַפּלאַמענערי פייג. 8 ק).ינטערעסטינגלי, דעם ענדערונג איז געווען באטייטיק ענכאַנסט פֿאַר דאַץ ין ראַפץ (Fig. 6c), ינדאַקייטינג אַז ווייַטער פּראָטעין קאַנדאַנסיישאַן פארגעקומען ביי דאַץ.אין שטיצן פון דעם, קיין באַטייטיק ענדערונג אין פלואָרעססענסע לעבן איז באמערקט פֿאַר αS/ΔNT-Tau דראַפּלאַץ אַלט פֿאַר 24 ה (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 8 ד), סאַגדזשעסטינג אַז דראַפּלאַט דזשעלאַטיאָן איז אַ פּראָצעס אַנדערש פון ספּאַטינג און וואָס איז נישט באגלייט דורך באַטייַטיק מאָלעקולאַר ריאָרגאַנאַזיישאַן אין קאָאַסערוואַץ.עס זאָל זיין אנגעוויזן אַז די דאַץ האָבן פאַרשידענע סיזעס און וועריאַבאַל אינהאַלט אין αS, ספּעציעל פֿאַר די αS/Tau441 סיסטעם (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 8 ע).די פאַרקלענערן אין אָרט פלואָרעססענסע לעבן איז געווען באגלייט דורך אַ פאַרגרעסערן אין ינטענסיטי, ספּעציעל פֿאַר Atto647N מיטן נאָמען טאַו441 (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 8אַ), און העכער FRET יפעקטיוונאַס פֿאַר ביידע αS/Tau441 און αS/ΔNT-Tau סיסטעמען, ינדאַקייטינג ווייַטער קאַנדאַנסיישאַן אין LLPS פינף שעה נאָך טריגערינג, די פּראָטעינס ין די סטאַטיק עלעקטרע קאַנדענסט.קאַמפּערד מיט αS/ΔNt-Tau, מיר באמערקט נידעריקער τ647N און אַ ביסל העכער τ488 וואַלועס אין αS/Tau441 ספּאַץ, באגלייט דורך נידעריקער און מער ינכאָומאַדזשיניאַס FRET וואַלועס.עפשער, דאָס קען זיין שייַכות צו דעם פאַקט אַז אין די αS/Tau441 סיסטעם, די באמערקט און דערוואַרט αS זעט אין אַגגרעגאַץ איז מער כעטעראַדזשיניאַס, אָפט סאַבסטאָוטשיאָמעטריק קאַמפּערד מיט טאַו, זינט טאַו441 זיך קען אויך אַנדערגאָו LLPS און אַגגרעגאַטיאָן (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 8 ע) .אָבער, דער גראַד פון דראָפּלעט קאָואַלעסאַנס, פּליט פאָרמירונג און, ימפּאָרטאַנטלי, פּראָטעין אַגגרעגאַטיאָן אין פליסיק-ווי קאָאַסערוואַץ איז מאַקסימום ווען ביידע טאַו441 און αS זענען פאָרשטעלן.
אַ לעבן פלואָרעססענסע מיקראָסקאָפּי (FLIM) בילדער פון αS/Tau441 און αS/ΔNt-Tau אין 25 μM פון יעדער פּראָטעין (1 μM AF488-לייבאַלד αS און 1μM Atto647N-לייבאַלד Tau441 אָדער ΔNt LL-Tau) באַפער.די שפאלטן ווייַזן רעפּריזענאַטיוו בילדער פון LLPS סאַמפּאַלז אין פאַרשידענע מאַטשוריישאַן צייט (30 מינוט, 5 שעה און 24 שעה).די רויט ראַם ווייזט די געגנט מיט αS/Tau441 ספּאַץ.לעבן ספּאַנס זענען געוויזן ווי קאָליר באַרס.וואָג באַר = 20 μם פֿאַר אַלע בילדער.ב זומד-אין FLIM בילד פון די אויסגעקליבן געגנט, געוויזן אין די רויט קעסטל אין טאַפליע אַ.לעבן ריינדזשאַז זענען געוויזן מיט די זעלבע קאָליר וואָג ווי אין טאַפליע אַ.וואָג באַר = 5 μם.c היסטאָגראַמס וואָס ווייַזן AF488 (אַטאַטשט צו αS) אָדער Atto647N (אַטאַטשט צו טאַו) פֿאַר פאַרשידענע פּראָטעין מינים (דראַפּלאַץ-ד-, פּליט-ר- און ספּעקקלע-P) יידענאַפייד אין FLIM בילדער רעקאָרדעד פֿאַר αS-) טיימינג דיסטריביושאַנז לעבן פון Tau441 און αS/ΔNT-Tau קאָאַסערוואַט סאַמפּאַלז (N = 17-32 ראָי פֿאַר ד, 29-44 ראָי פֿאַר ר, און 21-51 ראָי פֿאַר פונקטן).מיטל און מידיאַן וואַלועס זענען ריספּעקטיוולי געוויזן ווי געל סקווערז און שוואַרץ שורות אין באָקסעס.דער נידעריקער און אויבערשטער גרענעץ פון די קעסטל רעפּראַזענץ די ערשטער און דריט קוואַרטילעס, ריספּעקטיוולי, און די מינימום און מאַקסימום וואַלועס אין די 1.5-פאַרלייגן ינטערקוואַרטילע קייט (IQR) זענען געוויזן ווי וואָנצעס.אַוטלייערז זענען געוויזן ווי שוואַרץ דיימאַנדז.סטאַטיסטיש באַטייַט צווישן פּערז פון דיסטריביושאַנז איז באשלאסן ניצן אַ צוויי-מוסטער ה-פּרובירן, אַסומינג אַניקוואַל דיפעראַנסיז.צוויי-טיילד ה-טעסט פּ-וואַלועס זענען געוויזן מיט אַסטעריסק פֿאַר יעדער פּאָר פון קאַמפּערד דאַטן (* פּ-ווערט > 0.01, ** p-ווערט > 0.001, *** פּ-ווערט > 0.0001, **** פּ-ווערט > 0.00001), ns ינדיקייץ נעגלאַדזשאַבילאַטי (פּ-ווערט > 0.05).די פּינטלעך פּ וואַלועס זענען געגעבן אין סאַפּלאַמענטערי טאַבלע 1, און די אָריגינעל דאַטן זענען דערלאנגט ווי רוי דאַטן טעקעס.
צו ווייַטער באַווייַזן די אַמילאָיד-ווי נאַטור פון ספּעקאַלז / אַגגרעגאַץ, מיר באהאנדלט אַנסטיינד קאָאַסערוואַט סאַמפּאַלז פֿאַר 24 שעה מיט הויך קאַנסאַנטריישאַנז פון (1 ב) נאַקל, וואָס ריזאַלטיד אין די צעשיידונג פון אַגגרעגאַץ פון פּראָטעין קאָאַסערוואַטעס.ווען אפגעזונדערט אַגגרעגאַץ (ד"ה אַ דיספּערסט לייזונג פון אַגגרעגאַץ) זענען באמערקט מיט אַטאָמישע קראַפט מיקראָסקאָפּי (AFM), מיר באמערקט אַ פּרידאַמאַנאַנטלי ספעריש מאָרפאָלאָגי מיט אַ רעגולער הייך פון וועגן 15 נם, וואָס טענדז צו פאַרבינדן אונטער טנאָים פון הויך זאַלץ קאַנסאַנטריישאַן, ענלעך צו די נאַטור פון טיפּיש אַמילאָיד פיברילז רעכט צו דער שטאַרק הידראָפאָביק ווירקונג אויף די ייבערפלאַך (טאָן אַז פיברילז טיפּיקלי האָבן אַ הייך פון ~ קסנומקס נם) (סופּפּלעמענטאַרי פייג. קסנומקסאַ).ינטערעסטינגלי, ווען אפגעזונדערט אַגגרעגאַץ זענען ינגקיובייטיד מיט טהט אין אַ נאָרמאַל טהט פלואָרעססענסע אַססייַ, מיר באמערקט אַ דראַמאַטיק פאַרגרעסערן אין טהט פלואָרעססענסע קוואַנטום טראָגן, פאַרגלייַכלעך צו אַז באמערקט ווען די פאַרב איז ינגקיובייטיד מיט טיפּיש αS אַמילאָיד פיברילז (סאַפּלאַמענערי פייג. 10ב), סאַגדזשעסטינג אַז די קאָאַסערוואַט אַגגרעגאַץ אַנטהאַלטן אַמילאָיד-ווי סטראַקטשערז..אין פאַקט, די אַגגרעגאַץ זענען טאָלעראַנט צו הויך זאַלץ קאַנסאַנטריישאַנז אָבער שפּירעוודיק צו 4 ם גואַנידינע קלאָרייד (גדנהקל), ווי טיפּיש אַמילאָיד פיברילז (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 10 ק).
דערנאָך, מיר אַנאַלייזד די זאַץ פון די אַגגרעגאַץ מיט איין מאָלעקולאַר פלואָרעססענסע, ספּעציפיש פלואָרעססענסע קאָראַליישאַן / קרייַז-קאָראַליישאַן ספּעקטראַסקאָפּי (FCS / FCCS), און פּלאַצן אַנאַליסיס פון צוויי-קאָליר צופאַל דיטעקשאַן (TCCD).צו דעם סוף, מיר אפגעזונדערט אַגגרעגאַץ געשאפן נאָך 24 שעה פון ינגקיוביישאַן אין 100 μl LLPS סאַמפּאַלז מיט αS און Tau441 (ביידע 25 μM) צוזאַמען מיט 1 μM AF488-לייבאַלד αS און 1 μM Atto647N-labeled Tau441.צעפירן די ריזאַלטינג דיספּערסט געמיינזאַם לייזונג צו אַ מאָנאָמאָלעקולאַר שטאַט מיט דער זעלביקער PEG-פריי באַפער און 1 M NaCl (דער זעלביקער באַפער געניצט צו באַזונדער אַגגרעגאַץ פון קאָאַסערוואַט) צו פאַרמייַדן מעגלעך ילעקטראָוסטאַטיק ינטעראַקשאַנז צווישן LLPS און פּראָטעין.א ביישפיל פון די צייט טרייַעקטאָריע פון אַ איין מאָלעקולאַר קענען זיין געזען אין פיגורע 7אַ.פקס / פקס אַנאַליסיס (קרייַז-קאָראַליישאַן, קק און אַוטאָקאָראַליישאַן, אַק) געוויזן אַז אַגגרעגאַץ מיט αS און טאַו זענען שעפעדיק אין די סאַמפּאַלז (זען CC ויסבייג אין Fig. 7b, לינקס טאַפליע), און אַ וידעפדיק פון ריזידזשואַל מאָנאָמעריק פּראָטעין איז אויפגעשטאנען ווי אַ רעזולטאַט פון די דיילושאַן פּראָצעס (זען אַק קורוועס אין פיגורע 7ב, לינקס טאַפליע).קאָנטראָל יקספּעראַמאַנץ דורכגעקאָכט אונטער דער זעלביקער לייזונג טנאָים ניצן סאַמפּאַלז מיט בלויז מאָנאָמעריק פּראָטעינס געוויזן קיין קק קורוועס, און די אַק קורוועס פּאַסיק געזונט מיט די איין-קאָמפּאָנענט דיפיוזשאַן מאָדעל (עק. 4), ווו מאָנאָמעריק פּראָטעינס האָבן די דערוואַרט דיפיוזשאַן קאָואַפישאַנץ (פיגורע 7 ב). ), רעכט טאַפליע).די דיפיוזשאַן קאָואַפישאַנט פון אַגגרעגאַטעד פּאַרטיקאַלז איז ווייניקער ווי 1 μמ2 / s, און אַז פון מאָנאָמעריק פּראָטעינס איז וועגן 1 μמ2 / s.50-100 μm/s;וואַלועס זענען ענלעך צו ביז אַהער ארויס וואַלועס פֿאַר סאַניקייטיד αS אַמילאָיד פיברילז און מאָנאָמעריק αS סעפּעראַטלי אונטער ענלעך לייזונג טנאָים44.ווען מיר אַנאַלייזד די אַגגרעגאַץ מיט TCCD יקספּלאָוזשאַן אַנאַליסיס (Fig. 7c, שפּיץ טאַפליע), מיר געפֿונען אַז אין יעדער אפגעזונדערט געמיינזאַם (αS / Tau העטעראָאַגגראַגע), וועגן 60% פון די דיטעקטאַד אַגגרעגאַץ קאַנטיינד ביידע αS און טאַו, וועגן 30% קאַנטיינד בלויז בלויז וועגן 10% αS.סטאָיטשיאָמעטריק אַנאַליסיס פון αS / Tau העטעראָאַגדזשאַגראַטעס געוויזן אַז רובֿ פון די העטעראָאַגדזשאַגראַטעס זענען ענריטשט אין טאַו (סטאָושיאָמעטרי אונטער 0.5, די דורכשניטלעך נומער פון טאַו מאַלאַקיולז פּער אַגגרעגאַטע איז 4 מאל מער ווי αS מאַלאַקיולז), וואָס איז קאָנסיסטענט מיט אונדזער אַרבעט באמערקט אין FLIM אין סיטו יקספּעראַמאַנץ..FRET אַנאַליסיס געוויזן אַז די אַגגרעגאַץ קאַנטיינד ביידע פּראָטעינס, כאָטש די פאַקטיש FRET וואַלועס אין דעם פאַל זענען נישט פון גרויס וויכטיקייט, ווייַל די פאַרשפּרייטונג פון פלואָראָפאָרעס אין יעדער געמיינזאַם איז געווען טראַפ רעכט צו אַ וידעפדיק פון אַנלייבאַלד פּראָטעין געניצט אין דער עקספּערימענט.ינטערעסטינגלי, ווען מיר דורכגעקאָכט די זעלבע אַנאַליסיס מיט די 45,46 דערוואַקסן אַמילאָיד אַגגרעגאַטיאָן-דיפישאַנט טאַו וואַריאַנט (זען סאַפּלאַמענערי פייג. 11 אַ, ב), מיר באמערקט אַז כאָטש די αS ילעקטראָוסטאַטיק אַגגרעגאַטיאָן איז געווען די זעלבע (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 11 ק, ד), די פיייקייט צו פאָרעם אַגגרעגאַץ אין די קאָאַסערוואַט איז דראַסטיקלי רידוסט און FLIM דיטעקטאַד עטלעכע ספּאַץ אין אין סיטו יקספּעראַמאַנץ, און שוואַך קרייַז-קאָראַליישאַן קורוועס זענען באמערקט פֿאַר אפגעזונדערט געמיינזאַם סאַמפּאַלז.אָבער, פֿאַר אַ קליין נומער פון דיטעקטאַד אַגגרעגאַץ (בלויז איין צענט פון טאַו441), מיר באמערקט אַז יעדער אַגגרעגאַטע איז ענריטשט אין αS ווי דעם טאַו וואַריאַנט, מיט בעערעך 50% פון די דיטעקטאַד אַגראַגייץ מיט בלויז αS מאַלאַקיולז, און αS איז געווען כעטעראַדזשיניאַס אין וידעפדיק. .אַגגרעגאַץ (זען סאַפּלאַמענערי פייג. 11e), אין קאַנטראַסט צו די כעטעראַדזשיניאַס אַגגרעגאַץ דזשענערייטאַד דורך טאַו441 (פיג. 6ף).די רעזולטאַטן פון די יקספּעראַמאַנץ געוויזן אַז כאָטש αS זיך איז טויגעוודיק פון אַקיומיאַלייטינג מיט טאַו אין די קאָאַסערוואַט, טאַו נוקלעאַטיאָן איז מער גינציק אונטער די באדינגונגען, און די ריזאַלטינג אַמילאָיד-ווי אַגגרעגאַץ זענען ביכולת צו שפּילן ווי אַ פאָרעם פון αS און טאַו.אָבער, אַמאָל אַ טאַו-רייַך האַרץ איז געשאפן, העטעראָטיפּיק ינטעראַקשאַנז צווישן αS און טאַו זענען פייווערד אין אַגגרעגאַץ איבער האָמאָטיפּיק ינטעראַקשאַנז צווישן טאַו מאַלאַקיולז;מיר אויך אָבסערווירן פּראָטעין נעטוואָרקס אין פליסיק αS / טאַו קאָאַסערוואַטעס.
אַ רעפּריזענאַטיוו פלואָרעססענסע טעמפּעראַל טראַסעס פון איין מאַלאַקיולז פון אפגעזונדערט אַגגרעגאַץ געשאפן אין αS/Tau441 ילעקטראָוסטאַטיק קאָאַסערוואַטעס.בערסץ קאָראַספּאַנדינג צו αS / Tau441 קאָאַגגגאַטעס (בערסץ העכער די אנגעוויזן שוועל) זענען באמערקט אין דריי דיטעקשאַן טשאַנאַלז (AF488 און Atto647N ימישאַן נאָך דירעקט עקסייטיישאַן, בלוי און רויט שורות, Atto647N ימישאַן נאָך ומדירעקט עקסייטיישאַן), FRET, פיאַלקע שורה).ב FCS / FCCS אַנאַליסיס פון אַ מוסטער פון אפגעזונדערט αS / Tau441 אַגגרעגאַץ באקומען פֿון LLPS (לינקס טאַפליע).אַוטאָקאָרלאַטיאָן (אַק) קורוועס פֿאַר AF488 און Atto647N זענען געוויזן אין בלוי און רויט ריספּעקטיוולי, און קרייַז-קאָראַליישאַן (קק) קורוועס פֿאַרבונדן מיט אַגגרעגאַץ מיט ביידע דייז זענען געוויזן אין לילאַ.די אַק קורוועס פאַרטראַכטנ זיך די בייַזייַן פון לייבאַלד מאָנאָמעריק און אַגגרעגאַטעד פּראָטעין מינים, בשעת די CC קורוועס ווייַזן בלויז די דיפיוזשאַן פון טאָפּל-לייבאַלד אַגגרעגאַץ.דער זעלביקער אַנאַליסיס, אָבער אונטער די זעלבע לייזונג טנאָים ווי אין אפגעזונדערט ספּאַץ, סאַמפּאַלז מיט בלויז מאָנאָמעריק αS און Tau441 זענען געוויזן ווי קאָנטראָלס אין די רעכט טאַפליע.c פלואָרעססענסע בליץ אַנאַליסיס פון איין מאַלאַקיולז פון אפגעזונדערט אַגגרעגאַץ געשאפן אין αS/Tau441 ילעקטראָוסטאַטיק קאָאַסערוואַטעס.אינפֿאָרמאַציע פֿאַר יעדער געמיינזאַם געפֿונען אין פיר פאַרשידענע ריפּיץ (N = 152) איז פּלאַטיד קעגן זייער סטאָיטשיאָמעטרי, S וואַלועס און FRET עפעקטיווקייַט (שפּיץ טאַפליע, קאָליר באַר ריפלעקס פּאַסירונג).דריי טייפּס פון אַגגרעגאַץ קענען זיין אונטערשיידן: -αS-בלויז אַגגרעגאַץ מיט S~1 און FRET~0, Tau-בלויז אַגראַגייץ מיט S~0 און FRET~1, און כעטעראַדזשיניאַס טאַו / αS אַגראַגייץ מיט ינטערמידייט S און FRET עסטאַמאַץ פון די סומע פון ביידע מאַרקער פּראָטעינס דיטעקטאַד אין יעדער כעטעראַדזשיניאַס געמיינזאַם (N = 100) זענען געוויזן אין דער נידעריקער טאַפליע (די קאָליר וואָג ריפלעקס די פּאַסירונג).רוי דאַטן זענען צוגעשטעלט אין די פאָרעם פון רוי דאַטן טעקעס.
די מאַטשוריישאַן אָדער יידזשינג פון פליסיק פּראָטעין קאַנדאַנסייץ אין געל-ווי אָדער האַרט סטראַקטשערז איבער צייַט איז געמאלדן צו זיין ינוואַלווד אין עטלעכע פיזיאַלאַדזשיקאַל פאַנגקשאַנז פון די קאַנדאַנסייט47 ווי געזונט ווי אין קרענק, ווי אַ אַבנאָרמאַל פּראָצעס פּריסידינג אַמילאָיד אַגגרעגאַטיאָן 7, 48, 49. דאָ מיר לערנען פאַסע צעשיידונג און נאַטור אין דעטאַל.LSPT αS אין דעם בייַזייַן פון טראַפ - פּאָליקאַטיאָנס אין אַ קאַנטראָולד סוויווע אין נידעריק מיקראָמאָלאַר קאַנסאַנטריישאַנז און פיזיאַלאַדזשיקלי באַטייַטיק טנאָים (טאָן אַז די קאַלקיאַלייטיד פיזיאַלאַדזשיקאַל קאַנסאַנטריישאַן פון αS איז> 1 μM50), נאָך טיפּיש טהערמאָדינאַמיקאַללי געטריבן נאַטור פון לפּס.מיר געפֿונען אַז αS, וואָס כּולל אַ העכסט נעגאַטיוולי טשאַרדזשינג C-וואָקזאַל געגנט ביי פיזיאַלאַדזשיקאַל ף, איז ביכולת צו פאָרעם פּראָטעין-רייַך דראַפּלאַץ אין ייקוויאַס לייזונג דורך LLPS אין דעם בייַזייַן פון העכסט קאַטיאָניק דיסאָרדערד פּעפּטיידז אַזאַ ווי פּלק אָדער טאַו דורך דעם פּראָצעס פון ילעקטראָוסטאַטיק. קאָמפּלעקס קאַנדאַנסיישאַן אין דעם בייַזייַן פון אַגגרעגאַטיאָן מאַקראָמאָלעקולעס.דער פּראָצעס קען האָבן באַטייַטיק יפעקץ אין די סעליאַלער סוויווע ווו αS ינקאַונטערז פאַרשידן פּאָליקאַטיאָניק מאַלאַקיולז פֿאַרבונדן מיט זיין קרענק-פארבונדן אַגגרעגאַטיאָן ביידע אין וויטראָ און אין וויוואָ51,52,53,54.
אין פילע שטודיום, פּראָטעין דינאַמיק ין דראַפּלאַץ האָבן שוין גערעכנט ווי איינער פון די שליסל סיבות דיטערמאַנינג די מאַטשוריישאַן פּראָצעס55,56.אין ילעקטראָוסטאַטיק αS קאָאַסערוואַץ מיט פּאָליקאַטיאָנס, דער מאַטוראַטיאָן פּראָצעס משמעות דעפּענדס אויף די שטאַרקייט פון ינטעראַקשאַנז מיט פּאָליקאַטיאָנס, די וואַלאַנס און די קייפל פון די ינטעראַקשאַנז.יקוואַליבריאַם טעאָריע סאַגדזשעסץ אַז אַ יקוואַליבריאַם לאַנדשאַפט פון צוויי פליסיק שטאַטן וואָלט זיין די בייַזייַן פון אַ גרויס דראָפּלעט רייַך אין ביאָפּאָלימערס וואָס פירן LLPS57,58.דראָפּלעט וווּקס קענען זיין אַטשיווד דורך אָסטוואַלד מאַטוראַטיאָן59, קאָואַלעססענסע60 אָדער קאַנסאַמשאַן פון פריי מאָנאָמער אין די דיספּערסט פאַסע61.פֿאַר αS און Tau441, ΔNt-Tau אָדער pLK, רובֿ פון די פּראָטעין איז קאַנסאַנטרייטאַד אין די קאַנדאַנסייט אונטער די באדינגונגען געניצט אין דעם לערנען.אָבער, בשעת טאַו דראַפּלאַץ אין פול-גרייס קאָואַלעסטיד ראַפּאַדלי אויף ייבערפלאַך וועטינג, דראָפּלעט קאָואַלעסאַנס און וועטינג זענען שווער פֿאַר ΔNT-Tau און pLK, סאַגדזשעסטינג אַ גיך אָנווער פון פליסיק פּראָפּערטיעס אין די צוויי סיסטעמען.לויט אונדזער FLIM-FRET אַנאַליסיס, די אַלט pLK און ΔNt-Tau דראַפּלאַץ געוויזן אַ ענלעך גראַד פון פּראָטעין אַגגרעגאַטיאָן (ענלעך פלואָרעססענסע לעבן) ווי די אָריגינעל דראַפּלאַץ, סאַגדזשעסטינג אַז דער אָריגינעל פּראָטעין נעץ איז ריטיינד, כאָטש מער שטרענג.
מיר ראַשאַנאַלייז אונדזער יקספּערמענאַל רעזולטאַטן אין די פאלגענדע מאָדעל (פיגורע 8).די טכילעס טעמפּערעראַלי געשאפן דראַפּלאַץ זענען אָפט פּראָטעין נעטוואָרקס אָן ילעקטראָוסטאַטיק פאַרגיטיקונג, און אַזוי עס זענען געביטן פון אָפּצאָל ימבאַלאַנס, ספּעציעל אין די דראַפּלאַץ צובינד, ריזאַלטינג אין דראַפּלאַץ מיט אַ הויך ילעקטראָוסטאַטיק ייבערפלאַך פּאָטענציעל.צו פאַרגיטיקן פֿאַר אָפּצאָל (אַ דערשיינונג קאַמאַנלי ריפערד צו ווי וואַלענס דיפּלישאַן) און מינאַמייז די ייבערפלאַך פּאָטענציעל פון די דראַפּלאַץ, די דראַפּלאַץ קענען אַרייַננעמען נייַ פּאָליפּעפּטיידז פון די צעפירן פאַסע, ריאָרגאַנייז פּראָטעין נעטוואָרקס צו אַפּטאַמייז אָפּצאָל-טשאַרדזשינג ינטעראַקשאַנז און ינטעראַקט מיט אנדערע דראַפּלאַץ.מיט סערפאַסיז (וואַטינג).די αS / pLK דראַפּלאַץ, רעכט צו זייער סימפּלער פּראָטעין נעץ (בלויז העטעראָטיפּיק ינטעראַקשאַנז צווישן αS און pLK) און גרעסערע קירבות פֿאַר פּראָטעין-פּראָטעין ינטעראַקשאַנז, ויסקומען צו זיין ביכולת צו באַלאַנסירן די אָפּצאָל פון די קאַנדאַנסייט מער געשווינד;טאַקע, מיר באמערקט פאַסטער פּראָטעין קינעטיק אין טכילעס געשאפן αS / pLK קאָאַסערוואַטעס ווי אין αS / Tau.נאָך וואַלענס דיפּלישאַן, די ינטעראַקשאַנז ווערן ווייניקער יפעמעראַל און די דראַפּלאַץ פאַרלירן זייער פליסיק פּראָפּערטיעס און ווענדן אין געל-ווי, ניט-ברענעוודיק דראַפּלאַץ מיט אַ נידעריק ילעקטראָוסטאַטיק ייבערפלאַך פּאָטענציעל (און דעריבער קען נישט נאַס די ייבערפלאַך).אין קאַנטראַסט, αS / Tau דראַפּלאַץ זענען ווייניקער עפעקטיוו אין אָפּטימיזינג דראַפּלאַץ אָפּצאָל וואָג רעכט צו מער קאָמפּליצירט פּראָטעין נעטוואָרקס (מיט ביידע האָמאָטיפּיק און העטעראָטיפּיק ינטעראַקשאַנז) און די שוואַך נאַטור פון פּראָטעין ינטעראַקשאַנז.דאָס רעזולטאטן אין דראַפּלאַץ וואָס ריטיין פליסיק נאַטור פֿאַר עקסטענדעד פּיריאַדז פון צייט און האָבן אַ הויך ילעקטראָוסטאַטיק ייבערפלאַך פּאָטענציעל וואָס טענדז צו זיין מינאַמייזד דורך קאָואַלעססינג און גראָוינג (אַזוי מינאַמייז די ייבערפלאַך שטח / באַנד פאַרהעלטעניש פון די דראַפּלאַץ) און דורך וועטינג די כיידראָופיליק ייבערפלאַך כעם.דאָס קריייץ גרויס קאַנסאַנטרייטאַד פּראָטעין לייברעריז וואָס ריטיין פליסיק פּראָפּערטיעס ווייַל די ינטעראַקשאַנז בלייבן זייער טראַנזשאַנט רעכט צו דער קעסיידערדיק זוכן פֿאַר אָפּצאָל אַפּטאַמאַזיישאַן אין די פּראָטעין נעץ.ינטערעסטינגלי, N-טערמינאַל טראַנגקייטיד פארמען פון טאַו, אַרייַנגערעכנט עטלעכע געוויינטלעך געשעעניש יסאָפאָרמס 62, ויסשטעלונג ינטערמידייט נאַטור, מיט עטלעכע קאָאַסערוואַטעס יידזשינג מיט αS אין לאַנג-געלעבט געל-ווי דראַפּלאַץ, בשעת אנדערע יבערמאַכן אין גרויס פליסיק קאַנדאַנסייץ.די דואַליטי אין די מאַטשוריישאַן פון αS ילעקטראָוסטאַטיק קאָאַסערוואַטעס איז קאָנסיסטענט מיט די לעצטע LLPS טעאָרעטיש און יקספּערמענאַל שטודיום וואָס האָבן יידענאַפייד אַ קאָראַליישאַן צווישן וואַלענס דיפּלישאַן און ילעקטראָוסטאַטיק סיווינג אין קאַנדאַנסייץ ווי אַ שליסל צו קאַנטראָולינג קאַנדאַנסייט גרייס און פליסיק פּראָפּערטיעס.מעקאַניזאַם 58.61.
דער סכעמע ווייזט די פּאַטאַטיוו אַמילאָיד אַגגרעגאַטיאָן פּאַטוויי פֿאַר αS און Tau441 דורך LLPS און LSPT.מיט נאָך אַניאָן-רייַך (רויט) און קאַטיאָן-רייַך (בלוי) מקומות, αS און טאַו ילעקטראָוסטאַטיק קאָאַסערוואַטעס מיט באַפרידיקנדיק וואַלענס האָבן נידעריקער ייבערפלאַך ענערגיע און דעריבער ווייניקער קאָואַלעסאַנס, ריזאַלטינג אין גיך דראַפּלעט יידזשינג.א סטאַביל ניט-אַגלאָמעראַטעד געל שטאַט איז אַטשיווד..די סיטואַציע איז זייער גינציק אין דעם פאַל פון די αS / pLK סיסטעם רעכט צו זיין העכער קירבות און סימפּלער פּראָטעין-פּער ינטעראַקשאַן נעץ, וואָס אַלאַוז אַ שנעל געל-ווי יבערגאַנג.אויף די פאַרקערט, דראַפּלאַץ מיט אַנסאַטיספאַקטערי וואַלאַנס און, דעריבער, פּראָטעינס-טשאַרדזשד מקומות בנימצא פֿאַר ינטעראַקשאַן, מאַכן עס גרינגער פֿאַר די קאָאַסערוואַט צו פיוס און נאַס די כיידראָופיליק ייבערפלאַך צו רעדוצירן זייַן הויך ייבערפלאַך ענערגיע.די סיטואַציע איז בילכער פֿאַר αS / Tau441 קאָאַסערוואַטעס, וואָס האָבן אַ מולטיוואַלאַנט קאָמפּלעקס נעץ קאַנסיסטינג פון שוואַך טאַו-טאָו און αS-טאַו ינטעראַקשאַנז.אין קער, גרעסערע קאָאַסערוואַטעס וועט מער ריטיין זייער פליסיק-ווי פּראָפּערטיעס, אַלאַוינג אנדערע פּראָטעין-צו-פּראָטעין ינטעראַקשאַנז צו פּאַסירן.יווענטשאַוואַלי, אַמילאָיד כעטעראַדזשיניאַס אַגגרעגאַץ מיט ביידע αS און טאַו פאָרעם אין די קאָאַסערוואַט פליסיק, וואָס קען זיין שייַכות צו די געפֿונען אין ינקלוזשאַן ללבער, וואָס זענען כאַלמאַרקס פון נעוראָדעגענעראַטיווע חולאתן.
די גרויס פליסיק-ווי סטראַקטשערז געשאפן בעשאַס מאַטשוריישאַן פון αS / Tau441 מיט אַ העכסט קאַנדזשעסטיד אָבער דינאַמיש פּראָטעין סוויווע און, אין אַ ווייניקער מאָס, αS / ΔNT-Tau קאָאַסערוואַטעס זענען ידעאַל רעזערוווואַרז פֿאַר די נוקלעאַטיאָן פון פּראָטעין אַגגרעגאַטיאָן.מיר האָבן טאַקע באמערקט די פאָרמירונג פון האַרט פּראָטעין אַגגרעגאַץ אין דעם טיפּ פון פּראָטעין קאָאַסערוואַטעס, אָפט מיט ביידע αS און טאַו.מיר האָבן געוויזן אַז די העטעראָאַגראַגייץ זענען סטייבאַלייזד דורך ניט-ילעקטראָוסטאַטיק ינטעראַקשאַנז, זענען ביכולת צו בינדן אַמילאָיד-ספּעציפיש טהט דיעס אין די זעלבע וועג ווי טיפּיש אַמילאָיד פיברילז, און טאַקע האָבן ענלעך קעגנשטעל צו פאַרשידן ינפלואַנסיז.די αS / tau אַגגרעגאַץ געשאפן דורך LLPS זענען געוויזן צו האָבן אַמילאָיד-ווי פּראָפּערטיעס.טאקע, די דערוואַקסן וואַריאַנט פון טאַו דיפישאַנט אין אַמילאָיד אַגגרעגאַטיאָן איז באטייטיק ימפּערד אין די פאָרמירונג פון די כעטעראַדזשיניאַס αS אַגגרעגאַץ אין די פליסיק ילעקטראָוסטאַטיק קאָאַסערוואַט.די פאָרמירונג פון αS / Tau441 אַגגרעגאַץ איז באמערקט בלויז ין די קאָאַסערוואַטעס, וואָס ריטיינד פליסיק-ווי פּראָפּערטיעס, און קיינמאָל אויב די קאָאַסערוואַטעס / דראַפּלאַץ האָבן נישט דערגרייכן די געל שטאַט.אין די לעצטע פאַל, די געוואקסן שטאַרקייט פון ילעקטראָוסטאַטיק ינטעראַקשאַנז און, ווי אַ רעזולטאַט, די רידזשידאַטי פון די פּראָטעין נעץ פאַרמיידן די נויטיק קאַנפאָרמאַטיאָנאַל ריעריינדזשמאַנץ פון פּראָטעינס צו פאַרלייגן נייַ פּראָטעין ינטעראַקשאַנז נייטיק פֿאַר אַמילאָיד נוקלעאַטיאָן.אָבער, דאָס קענען זיין אַטשיווד אין מער פלעקסאַבאַל, פליסיק-ווי קאָאַסערוואַטעס, וואָס אין קער זענען מער מסתּמא צו בלייַבן פליסיק ווי זיי פאַרגרעסערן אין גרייס.
דער פאַקט אַז די פאָרמירונג פון אַגגרעגאַץ אין די קאַנדענסט פאַסע איז בילכער אין גרויס αS / Tau קאַנדאַנסייץ ווי אין קליין דראַפּלאַץ וואָס ראַפּאַדלי געל, כיילייץ די שייכות פון ידענטיפיצירן די סיבות וואָס קאָנטראָלירן דראָפּלעט קאָואַלעסאַנס.אזוי, ניט בלויז איז עס אַ טענדענץ פֿאַר פאַסע צעשיידונג, אָבער די גרייס פון די קאַנדאַנסייט מוזן זיין קאַנטראָולד פֿאַר געהעריק פאַנגקשאַנינג ווי געזונט ווי קרענק פאַרהיטונג 58,61.אונדזער רעזולטאַטן אויך הויכפּונקט די וויכטיקייט פון די וואָג צווישן LLPS און LSPT פֿאַר די αS / Tau סיסטעם.בשעת דראַפּלאַט פאָרמירונג קען באַשיצן קעגן אַמילאָיד אַגגרעגאַטיאָן דורך רידוסינג די סומע פון פּראָטעין מאָנאָמערס בנימצא אונטער זעטיקונג טנאָים, ווי עס איז געווען פארגעלייגט אין אנדערע סיסטעמען63,64, דראַפּלאַט פוסיאָן אין הויך דראַפּלאַט לעוועלס קען פירן צו ינערלעך פּראָטעין אַגגרעגאַטיאָן דורך פּאַמעלעך קאַנפאָרמיישאַן ריעריינדזשמאַנץ.פּראָטעין נעטוואָרקס..
קוילעלדיק, אונדזער דאַטן שטארק ונטערשטרייַכן די שייכות פון קאָוכיסיוו וואַלאַנס און צופֿרידן / אַנסאַטיספייד ינטעראַקשאַנז אין קאַפּ נעטוואָרקס אין דעם קאָנטעקסט פון LSPT.אין באַזונדער, מיר ווייַזן אַז פול-לענג αS / Tau441 קאַנדאַנסייץ זענען ביכולת צו יפישאַנטלי פיוס און קערן צו פאָרעם אַמילאָיד-ווי העטעראָאַגגראַגאַטעס וואָס אַנטהאַלטן ביידע פּראָטעינס און פאָרשלאָגן אַ מאָלעקולאַר מעקאַניזאַם באזירט אויף אונדזער יקספּערמענאַל רעזולטאַטן.די קאָ-אַגגאַגיישאַן פון צוויי פּראָטעינס אין די αS / Tau פליסיק קאָאַסערוואַט וואָס מיר באַריכט דאָ קען טאַקע זיין שייַכות צו די קאָ-לאָוקאַלאַזיישאַן פון צוויי פּראָטעינס אין ינקלוזשאַנז, וואָס זענען כאַלמאַרקס פון די קרענק, און קען ביישטייערן צו פארשטאנד די שייכות צווישן LLPS און אַמילאָיד אַגגרעגאַטיאָן, פּייווינג דעם וועג פֿאַר העכסט באפוילן IDP אין נעוראָדעגענעראַטיאָן.
מאָנאָמעריק WT-αS, סיסטינע מיוטאַנץ (Q24C-αS, N122C-αS) און ΔCt-αS וועריאַנץ (Δ101-140) זענען אויסגעדריקט אין E. קאָלי און פּיוראַפייד ווי פריער דיסקרייבד.5 מם דטט איז אַרייַנגערעכנט אין אַלע סטעפּס אין די רייניקונג פון αS סיסטינע מיוטאַנץ צו פאַרמייַדן דיסולפידע בונד פאָרמירונג.טאַו441 יסאָפאָרם (פּלאַסמיד באקומען פון אַדדזשין #16316), אַנט-טאַו וואַריאַנט (Δ1-150, באקומען דורך קלאָונינג יוואַ מיט פּרימערז CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) און AggDef-2TAu5C Variant (Δ1-15CT) און אַגגדעף-2,5ק פּיוראַפייד. קאָלי קאַלטשערז געווען געוואקסן צו OD600 = 0.6-0.7 ביי 37 ° C און 180 רפּם, און די אויסדרוק איז ינדוסט מיט IPTG פֿאַר 3 שעה ביי 37 ° C.שניט סעלז ביי 11,500 קסג פֿאַר 15 מינוט ביי 4 °C און וואַשן מיט סאַלין באַפער מיט 150 מם נאַקל.רעסאַספּענשאַן די שרייטל אין ליסיס באַפער (20 מל פּער 1 ל לב: MES 20 מם, ף 6.8, נאַקל 500 מם, עדטאַ 1 מם, מגקל2 0.2 מם, דטט 5 מם, פּמסף 1 מם, בענזאַמידינע 50 μם, קאָפּעפּטין 1).די סאָניקאַטיאָן שריט איז דורכגעקאָכט אויף אייז מיט אַ אַמפּליטוד פון 80% פֿאַר 10 פּאַלסיז (1 מין אויף, 1 מין אַוועק).דו זאלסט נישט יקסיד 60 מל אין איין אַלטראַסאַונד.י קאָלי ליסאַטעס זענען העאַטעד בייַ 95 ° סי פֿאַר 20 מינוט, דעמאָלט קולד אויף אייז און סענטריפוגעד בייַ 127,000 × ג פֿאַר 40 מינוט.די קלעראַפייד סופּערנאַטאַנט איז געווען געווענדט צו אַ 3.5 kDa מעמבראַנע (ספּעקטרום ™ טערמאָו פישער ססיענטיפיק, וק) און דייאַליייזד קעגן 4 ל פון דייאַליסיס באַפער (20 מם מעס, ף 6.8, נאַקל 50 מם, עדטאַ 1 מם, מגקל 2 2 מם, דטט 2 מם PMSF 0.1 מם) פֿאַר 10 שעה.א 5 מל קאַטיאָן וועקסל זייַל (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) איז יקוואַליברייטיד מיט יקוואַליבריישאַן באַפער (20 מם מעס, פּה 6.8, 50 מם נאַקל, 1 מם עדטאַ, 2 מם מגקל2, 2 מם דטט, 0.1 מם PMSF).די טאַו ליסאַטע איז געפילטערט דורך אַ 0.22 μm פּווודף פילטער און ינדזשעקטיד אין די זייַל מיט אַ לויפן קורס פון 1 מל / מין.ילוטיאָן איז דורכגעקאָכט ביסלעכווייַז, טאַו איז געווען ילוטאַד מיט 15-30% ילושאַן באַפער (20 מם מעס, ף 6.8, 1 ם נאַקל, 1 מם עדטאַ, 2 מם מגקל2, 2 מם דטט, 0.1 מם פּמסף).פראַקשאַנז זענען אַנאַלייזד דורך SDS-PAGE, און קיין פראַקשאַנז מיט איין באַנד מיט די דערוואַרט מאָלעקולאַר וואָג פון טאַו זענען קאַנסאַנטרייטאַד מיט אַ 10 kDa סענטריפוגע פילטער און ריפּלייסט מיט אַ באַפער מיט 10 מם HEPES, pH 7.4, NaCl 500 מם און DTT 2 מם פֿאַר די לעצט פּראָטעין קאַנסאַנטריישאַן איז געווען 100 μם.דער פּראָטעין לייזונג איז דערנאָך דורכגעגאנגען דורך אַ 0.22 μם פּווודף פילטער, געשווינד פאַרפרוירן און סטאָרד ביי -80 ° C.פּראָטעינס ק18 איז ליב צוגעשטעלט דורך פּראָפעסאָר אַלבערטאָ באָפי.די ריינקייַט פון דער צוגרייטונג איז געווען>95% ווי באשטעטיקט דורך SDS-PAGE און MALDI-TOF/TOF.פאַרשידן סיסטעינז זענען כעמיש לייבאַלד מיט AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) אָדער TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada).זענען באשטעטיקט דורך אַבזאָרבאַנס און MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau און K18 זענען לייבאַלד מיט געבוירן סיסטינע רעזאַדו אין שטעלעס 191 און 322 ניצן Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, דייַטשלאַנד) נאָך דער זעלביקער פּראָצעדור.נעץ אָפּצאָל פּער רעזאַדו מאַפּס פֿאַר αS און Tau441 זענען דזשענערייטאַד מיט CIDER66.
האַרט פּאָלי-ל-ליסינע (פּLK DP 90-110 לויט צו נמר פון סאַפּלייער, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) איז צעלאָזן אין 10 מם העפּעס, 100 מם נאַקל, pH 7.4 צו 10 מם קאַנסאַנטריישאַן, פּראָצעס סאָניקאַטעד פֿאַר 5 מינוט אין אַן אַלטראַסאַניק וואַסער וואַנע און קראָם בייַ -20 °C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) און FITC-dextran-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, USA) זענען וואַסער סאַליאַבאַל און וויידלי פונאנדערגעטיילט אין LLPS באַפער.דיאַליסיס רימוווז קאַנטאַמאַנייטינג סאָלץ.זיי זענען דעמאָלט פילטערד דורך אַ שפּריץ פילטער מיט אַ פּאָרע גרייס פון 0.22 μם, און זייער קאַנסאַנטריישאַנז זענען קאַלקיאַלייטיד מיט אַ רעפראַקטאָמעטער (מעטלער טאָלעדאָ, קאָלומבוס, אָהיאָ, USA).LLPS סאַמפּאַלז זענען צוגעגרייט אין צימער טעמפּעראַטור אין די פאלגענדע סדר: באַפער און יקסטרוזשאַן זענען געמישט און 1 מם טריס (2-קאַרבאָקסיעטהיל) פאָספינע (TCEP, Carbosynth, Compton, וק), 1 מם 2,2,2,2-(עטהאַנע- 1, 2-דיילדיניטרילע) טעטראַאַסעטיק זויער (עדטאַ, קאַרבאָקסינטה) און אַ געמיש פון 1% פּראָטעאַסע ינכיבאַטער (PMSF 100 מם, בענזימידע 1 מם, לעופּעפּטין 5 μם).דערנאָך αS און פיוזד פּאָליקאַטיאָנס (אָפּציעס pLK אָדער Tau) זענען צוגעגעבן.פֿאַר טהיאָפלאַווין-ט צייט סעריע יקספּעראַמאַנץ (טהט, קאַרבאָסינטה, קאָמפּטאָן, וק), נוצן די גאַנץ טהט קאַנסאַנטריישאַן צו זיין האַלב די αS קאַנסאַנטריישאַן.דזשענטלי אָבער ונ דורך מישן די סאַמפּאַלז צו ענשור זיי זענען כאָומאַדזשיניאַס.די קאַנסאַנטריישאַן פון יעדער קאָמפּאָנענט וועריד פון עקספּערימענט צו עקספּערימענט, ווי דיסקרייבד אין די רעזולטאַטן אָפּטיילונג.אַזידע איז געניצט אין אַ קאַנסאַנטריישאַן פון 0.02% (וו / וו) ווען דער געדויער פון דער עקספּערימענט יקסיד 4 שעה.פֿאַר אַלע אַנאַליזעס ניצן LLPS סאַמפּאַלז, לאָזן די געמיש יקוואַליברייט פֿאַר 5 מינוט איידער אַנאַליסיס.פֿאַר ליכט צעוואָרפן אַנאַליסיס, 150 μל סאַמפּאַלז זענען לאָודיד אויף ניט-ביינדינג 96-געזונט מיקראָפּלאַטעס (μClear®, שוואַרץ, F-Bottom / Chimney Well, Greiner Bio-One, Kremsmünster, עסטרייַך) און באדעקט מיט קלעפּיק פילם.LLPs זענען מאָניטאָרעד דורך מעסטן אַבזאָרבאַנס ביי 350 נם אין די צענטער פון די לייזונג אין אַ CLARIOstar טעלער לייענער (BMG Labtech, Ortenberg, דייַטשלאַנד).די יקספּעראַמאַנץ זענען דורכגעקאָכט אין טריפּליקאַט ביי 25 ° C, און די ערראָרס זענען קאַלקיאַלייטיד ווי די נאָרמאַל דיווייישאַן פון די דורכשניטלעך.די צעפירן פאַסע איז קוואַנטאַפייד דורך מוסטער סענטריפוגאַטיאָן און SDS-PAGE געל אַנאַליסיס, און די αS בראָכצאָל אין די צעפירן און קאַנסאַנטרייטאַד פאַסעס איז קוואַנטאַפייד אין פאַרשידן LLPS סאַלושאַנז.א 100 μl LLPS מוסטער מיט 1 μM AF488-לייבאַלד αS איז געווען צוגעגרייט דורך גרונטיק מיקסינג נאכגעגאנגען דורך סענטריפוגאַטיאָן ביי 9600 × ג פֿאַר 30 מינוט, נאָך וואָס די אָפּזאַץ איז יוזשאַוואַלי קענטיק.די שפּיץ 50 μל פון די סופּערנאַטאַנט איז געניצט פֿאַר פּראָטעין קוואַנטאַפאַקיישאַן ניצן SDS-PAGE געל.דזשעלז זענען סקאַנד מיט AF488 פילטערס מיט אַ ChemiDoc געל ימידזשינג סיסטעם (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) אָדער סטיינד מיט Coomassie פלעק און וויזשוואַלייזד מיט צונעמען פילטערס.די ריזאַלטינג באַנדס זענען אַנאַלייזד מיט ImageJ ווערסיע 1.53i (נאַשאַנאַל ינסטיטוטעס פון געזונט, USA).די יקספּעראַמאַנץ זענען דורכגעקאָכט אין דופּליקאַט אין צוויי פאַרשידענע יקספּעראַמאַנץ מיט ענלעך רעזולטאַטן.
טיפּיקאַללי, 150 μל סאַמפּאַלז זענען געווענדט צו ניט-ביינדינג 96-געזונט מיקראָפּלאַטעס און וויזשוואַלייזד אין צימער טעמפּעראַטור אויף אַ Leica DMI6000B ינווערטיד מיקראָסקאָפּ (Leica Microsystems, Wetzlar, דייַטשלאַנד).פֿאַר אָרט יקספּעראַמאַנץ, μ-Slide Angiogenesis פּלאַטעס (Ibidi GmbH, Gräfelfing, דייַטשלאַנד) אָדער 96-געזונט פּאַליסטיירין מיקראָפּלאַטעס (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) זענען אויך געניצט.EL6000 האַלאָגען אָדער קוועקזילבער מעטאַל כאַלייד לאמפן זענען געניצט ווי ילומאַניישאַן קוואלן (פֿאַר BF / DIC און WF ימאַגינג ריספּעקטיוולי).פֿאַר WF מיקראָסקאָפּי, אַ 40 קס מאַגנאַפאַקיישאַן לופט אָביעקטיוו (Leica Microsystems, דייַטשלאַנד) איז געניצט צו פאָקוס די ליכט אויף די מוסטער און קלייַבן עס.פֿאַר AF488 און ThT לייבאַלד סאַמפּאַלז, פילטער עקסייטיישאַן און ימישאַן מיט נאָרמאַל GFP פילטער שטעלט, יקסייטיישאַן און ימישאַן באַנדפּאַסס פילטערס, ריספּעקטיוולי, 460-500 nm און 512-542 nm באַנדפּאַסס פילטערס, און אַ 495 nm דיקראָיק שפּיגל.פֿאַר סאַמפּאַלז מיט Atto647N, אַ נאָרמאַל גאַנג פון Cy5 פילטערס מיט יקסייטיישאַן און ימישאַן באַנדפּאַסס פילטערס 628-40 nm און 692-40 nm, ריספּעקטיוולי, און אַ 660 nm דיקראָיק שפּיגל זענען געניצט.פֿאַר BF און DIC מיקראָסקאָפּי, נוצן די זעלבע אָביעקטיוו פון שפיגלט ליכט זאַמלונג.די געזאמלט ליכט איז רעקאָרדעד אויף אַ Leica DFC7000 CCD אַפּאַראַט (Leica Microsystems, דייַטשלאַנד).די ויסשטעלן צייט איז געווען 50 מיז פֿאַר BF און DIC מיקראָסקאָפּי ימאַגינג און 20-100 מיז פֿאַר WF מיקראָסקאָפּי ימאַגינג.פֿאַר פאַרגלייַך, די ויסשטעלן צייט פֿאַר אַלע יקספּעראַמאַנץ מיט ThT איז געווען 100 מיז.צייט-לויפן יקספּעראַמאַנץ זענען דורכגעקאָכט צו וויזשוואַלייז דראָפּלעט קאָואַלעסאַנס, מיט בילדער זענען געזאמלט יעדער 100 מיז פֿאַר עטלעכע מינוט.ImageJ (NIH, USA) איז געניצט פֿאַר בילד אַנאַליסיס.די יקספּעראַמאַנץ זענען דורכגעקאָכט אין דרייַסיק מיט ענלעך רעזולטאַטן.
פֿאַר קאָלאָקאַליזאַטיאָן יקספּעראַמאַנץ, FRAP און 3D ריקאַנסטראַקשאַן, בילדער זענען קונה אויף אַ Zeiss LSM 880 ינווערטיד קאָנפאָקאַל מיקראָסקאָפּ ניצן אַ ZEN 2 בלוי אַדישאַן (Carl Zeiss AG, Oberkochen, דייַטשלאַנד).סאַמפּאַלז פון 50 μל זענען געווענדט צו μ-Slide Angiogenesis Petri קיילים (Ibidi GmbH, Gröfelfing, דייַטשלאַנד), באהאנדלט מיט אַ כיידראָופיליק פּאָלימער (ibiTreat) און מאָונטעד אין אַ 63× ייל טבילה אָביעקטיוו (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 אָיל) אויף DIC).בילדער זענען קונה מיט 458 nm, 488 nm און 633 nm אַרגאָן לאַזער שורות מיט אַ האַכלאָטע פון 0.26 μm / פּיקסעל און אַ ויסשטעלן צייט פון 8 μs / פּיקסעל פֿאַר יקסייטיישאַן און ימישאַן דיטעקשאַן פֿענצטער פון 470-600 nm, 493-6, 28 נם. און 638-755 nm איז געניצט צו וויזשוואַלייז ThT, AF488 און Atto647N, ריספּעקטיוולי.פֿאַר די FRAP יקספּעראַמאַנץ, צייט-לויפן פאָטאָגראַפיע פון יעדער מוסטער איז רעקאָרדעד אין 1 ראַם פּער סעקונדע.די יקספּעראַמאַנץ זענען געפירט אויס אין טריפּליקאַט אין צימער טעמפּעראַטור מיט ענלעך רעזולטאַטן.אַלע בילדער זענען אַנאַלייזד ניצן Zen 2 בלוי אַדישאַן ווייכווארג (Carl Zeiss AG, Oberkochen, דייַטשלאַנד).די FRAP קורוועס זענען נאָרמאַלייזד, פּלאַטיד און פיטאַד צו ינטענסיטי / צייט דאַטן יקסטראַקטיד פון בילדער ניצן Zen 2 ניצן OriginPro 9.1.די אָפּזוך קורוועס זענען פיטאַד צו אַ מאָנאָ-עקספּאָונענטיאַל מאָדעל צו רעכענען מאָלעקולאַר דיפיוזשאַן מיט אַן נאָך עקספּאָונענשאַל טערמין צו רעכענען די אַקוואַזישאַן בליטשינג ווירקונג.מיר דעמאָלט קאַלקיאַלייטיד ד ניצן די נאָמינאַל בליטשינג ראַדיוס און די פריער באשלאסן אָפּזוך האַלב-לעבן ווי אין די יקווייזשאַן פון קאַנג עט על.5 35 געוויזן.
איין סיסטינע וועריאַנץ פון αS זענען סינטאַסייזד מיט 4-כיידראָקסי-2,2,6,6-טעטראַמעטהילפּיפּערידינע-ען-אָקסיל (TEMPOL) אין שטעלעס 24 (TEMPOL-24-αS) און 122 (TEMPOL-122-αS), ריספּעקטיוולי.ספּין לאַבעלינג פֿאַר EPR יקספּעראַמאַנץ, די αS קאַנסאַנטריישאַן איז געווען באַשטימט צו 100 μM און די PEG קאַנסאַנטריישאַן איז געווען 15% (וו / וו).פֿאַר פאַרשידן אַגגרעגאַטיאָן טנאָים, די αS: pLK פאַרהעלטעניש איז געווען 1:10, בשעת די αS:ΔNT-Tau און αS:Tau441 ריישיאָוז זענען מיינטיינד ביי 1:1.פֿאַר ביינדינג טיטריישאַן יקספּעראַמאַנץ אין דער אַוועק פון קראַוד, TEMPOL-122-αS איז געווען מיינטיינד ביי 50 μם און פּאָליקאַטיאָנס זענען טיטרייטיד אין ינקריסינג קאַנסאַנטריישאַנז, פּריפּערינג יעדער צושטאַנד סעפּעראַטלי.CW-EPR מעזשערמאַנץ זענען דורכגעקאָכט מיט אַ Bruker ELEXSYS E580 X-באַנד ספּעקטראָמעטער יקוויפּט מיט אַ Bruker ER4118 SPT-N1 רעסאָנאַטאָר אַפּערייטינג אין אַ מייקראַווייוו (SHF) אָפטקייַט פון ~ 9.7 GHz.די טעמפּעראַטור איז געווען באַשטימט בייַ 25 ° C און קאַנטראָולד דורך אַ פליסיק ניטראָגען קריאָסטאַט.די ספּעקטראַ זענען באקומען אונטער אַנסאַטשערייטיד טנאָים מיט אַ MW מאַכט פון 4 מוו, אַ מאַדזשאַליישאַן אַמפּליטוד פון 0.1 מט און אַ מאַדזשאַליישאַן אָפטקייַט פון 100 כז.ספּעקטראַל ינטענסיטיעס זענען נאָרמאַלייזד צו ויסמיידן דיפעראַנסיז אין ומדריי קאַנסאַנטריישאַנז צווישן סאַמפּאַלז און מעגלעך ומדריי רעדוקציע רעכט צו ריזידזשואַל קאַנסאַנטריישאַנז פון רידוסינג אגענטן אין סאַמפּאַלז מיט Tau441 אָדער ΔNt-Tau (פאָרשטעלן אין דער אָריגינעל פּראָטעין סאַלושאַנז).די געגעבן וואַלועס פון ג זענען באקומען ווי אַ רעזולטאַט פון EPR ספּעקטראַל מאָדעלינג דורכגעקאָכט מיט די Easyspin ווייכווארג (וו. 6.0.0-dev.34) ימפּלאַמענאַד אין Matlab®67.איינער / צוויי קאָמפּאָנענט יסאָטראָפּיק מאָדעלס זענען געניצט צו מאָדעל די דאַטן.נאָך נאָרמאַלייזינג אַלע סיגנאַלז, די רעזידאַנץ זענען קאַלקיאַלייטיד דורך סאַבטראַקטינג יעדער סימיאַליישאַן פון די קאָראַספּאַנדינג יקספּערמענאַל ספּעקטרום.פֿאַר ביינדינג טיטריישאַן אַנאַליסיס, די קאָרעוו ינטענסיטי פון די דריט באַנד צו די רגע באַנד פון די נאָרמאַלייזד EPR ספּעקטרום (III / III) איז געניצט צו מאָניטאָר די ביינדינג פון פּאָליקאַטיאָנס צו αS.צו אָפּשאַצן די דיססאָסיאַטיאָן קעסיידערדיק (Kd), די ריזאַלטינג ויסבייג איז געווען פיטאַד צו אַ דערנענטערנ מאָדעל אַסומינג n יידעניקאַל און פרייַ ביינדינג זייטלעך.
נמר ספּעקטראָסקאָפּי יקספּעראַמאַנץ זענען דורכגעקאָכט מיט אַ Bruker Neo 800 מהז (1 ה) נמר ספּעקטראָמעטער יקוויפּט מיט אַ קריאָפּראָבע און ז-גראַדיענט.אַלע יקספּעראַמאַנץ זענען דורכגעקאָכט מיט 130-207 μM αS און קאָראַספּאַנדינג αS / ΔNT-Tau און pLK יקוויוואַלאַנץ אין 10 מם העפּעס, 100 מם נאַקל, 10% DO, pH 7.4 און זענען דורכגעקאָכט ביי 15 ° C.צו מאָניטאָר לפּס דורך נמר, 10% PEG איז צוגעגעבן צו די פאַר-געמישט סאַמפּאַלז.די כעמישער יבעררוק פּערטערביישאַן פּלאַנעווען (Fig. 1 ב) ווייזט די דורכשניטלעך 1 ה און 15 ן כעמיש שיפץ.די αS 2D1H-15N HSQC ספּעקטראַ זענען אַסיינד באזירט אויף אַ פריערדיקן אַסיינמאַנט (BMRB פּאָזיציע #25227) און באשטעטיקט דורך רעקאָרדינג און אַנאַלייזינג די 3D ספּעקטראַ פון HNCA, HNCO און CBCAcoNH.13Cα און 13Cβ כעמיש שיפץ זענען קאַלקיאַלייטיד אין דעם בייַזייַן פון ΔNt-Tau אָדער pLK צו מעסטן מעגלעך ענדערונגען אין צווייטיק סטרוקטור טרענדס קאַמפּערד מיט αS כעמיש שיפץ אין ריין טראַפ - שפּול קאַנפאָרמיישאַן 68 (סופּפּלעמענטאַרי פיגור 5c).די R1ρ ראַטעס זענען געמאסטן דורך רעקאָרדינג הסקקטרעטפ3גפּסי יקספּעראַמאַנץ (דערגרייכט פון די Bruker ביבליאָטעק) מיט דילייז פון 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 און 800 מס, און די עקספּאָונענשאַל פאַנגקשאַנז זענען אַדזשאַסטיד צו די שפּיץ ינטענסיטי. צייט צו באַשטימען די R1ρ און זייַן יקספּערמענאַל אַנסערטאַנטי.
צוויי-קאָליר צייט ריזאַלווד פלואָרעססענסע מיקראָסקאָפּי יקספּעראַמאַנץ זענען דורכגעקאָכט אויף אַ געשעפט צייט-סאַלווד MT200 פלואָרעססענסע קאָנפאָקאַל מיקראָסקאָפּ (PicoQuant, בערלין, דייַטשלאַנד) מיט אַ צייט-קאָראַלייטיד איין פאָטאָן קאַונטינג (TCSPC) מיטל.די לאַזער דייאָוד קאָפּ איז געניצט פֿאַר פּולסעד ינטערלעאַוועד עקסייטיישאַן (PIE), דער שטראַל פּאַסיז דורך אַ איין מאָדע וואַוועגייד און איז טונד צו אַ לאַזער מאַכט פון 10 צו 100 נוו פֿאַר 481 nm און 637 nm לאַזער שורות געמאסטן נאָך אַ דיקראָיק שפּיגל.דאָס ינשורז אַן אָפּטימאַל פאָטאָן קאַונטינג קורס, אַוווידיד די יפעקץ פון פאָטאָן אַליאַסינג, פאָטאָבליטשינג און זעטיקונג.μ-Slide אַנגיאָגענעסיס קאָווערסליפּס אָדער פּלאַטעס (Ibidi GmbH, Gräfelfing, דייַטשלאַנד) זענען געשטעלט גלייַך אין טבילה וואַסער איבער אַ Super Apochromat 60x NA 1.2 אָביעקטיוו מיט אַ קערעקטיוו קאָלנער (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).א 488/640 נם דיקראָיק שפּיגל (Semrock, Lake Forest, IL, USA) איז געניצט ווי די הויפּט שטראַל ספּליטטער.ונפאָקוסעד ראַדיאַציע איז אפגעשטעלט דורך אַ לאָך מיט אַ דיאַמעטער פון 50 מייקראַנז, און די פאָוקיסט ראַדיאַציע איז צעטיילט אין 2 דיטעקשאַן פּאַטס דורך אַ 50/50 שטראַל ספּליטטער.באַנדפּאַסס ימישאַן פילטערס (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 פֿאַר גרין פאַרב (AF488) און 690/70 פֿאַר רויט פאַרב (Atto647N) זענען געניצט אין פראָנט פון די דיטעקטער.איין-פאָטאָן לאַווינע דיאָדעס (ספּאַד) (מיקראָ פאָטאָן דעוויסעס, באָלזאַנאָ, איטאליע) זענען געניצט ווי דעטעקטאָרס.ביידע דאַטן זאַמלונג און אַנאַליסיס זענען דורכגעקאָכט מיט די קאמערשעל בנימצא SymphoTime64 ווייכווארג (PicoQuant GmbH, בערלין, דייַטשלאַנד).
פופציק מיקראָליטערז פון LLPS סאַמפּאַלז זענען געווענדט צו μ-Slide אַנגיאָגענעסיס וועלז (Ibidi GmbH, Gräfelfing, דייַטשלאַנד).די ריזאַלטינג בילדער זענען פאָוקיסט צו 20 μm אויבן די געזונט דנאָ פֿאַר אָפּטימאַל אָביעקטיוו אַרבעט דיסטאַנסע פֿאַר סוספּענדעד דראַפּלאַץ און צו ~ 1 μm פֿאַר ראַפץ און דאַץ מיט אַ אַקסיאַל האַכלאָטע פון בייַ מינדסטער 0.25 μm / פּיקסעל און אַ פאַרהאַלטן צייט פון 400 μs / פּיקסעל.סעלעקטירן דאַטן דורך אַפּלייינג אַ ינטענסיטי שוועל באזירט אויף די דורכשניטלעך הינטערגרונט סיגנאַל ינטענסיטי (PBG, מיינען + 2σ) פֿאַר יעדער קאַנאַל אַזוי אַז בלויז פליסיק פּראָטעין דראַפּלאַץ, ראַפץ אָדער ספּאַץ זענען אויסגעקליבן, פילטערינג קיין מעגלעך אָנהייב פון די דיספּערסט פאַסע.צו אַנאַלייז די לעבן פון יעדער מינים (τ) פון יעדער קאַנאַל (גרין, "ג" פֿאַר AF488 און רויט, "ר" פֿאַר Atto647N), מיר אויסגעקליבן געגנטן פון אינטערעס (ROIs) מיט דראַפּלאַץ, ראַפץ אָדער ספּאַץ (סופּפּלעמענטאַרי פיגור 1) ).8ב) און דערייווד זיי דורך פּאַסן זייער לעבן פאַרפוילן (τד, τר און τפּ פֿאַר דראַפּלאַץ, ראַפץ אָדער ספּאַץ, ריספּעקטיוולי, זען סאַפּלאַמענערי פייג. 8ק) אין יעדער קאַנאַל ניצן אַ עק-פּאַסיק אַנאַליסיס און אַ צוויי-קאָמפּאָנענט פאַרפוילן מאָדעל.דורכשניטלעך τ פֿון τ.ROIs וואָס האָבן געשאפן צו ווייניק פאָטאָנס פֿאַר אַ מולטי-עקספּאָונענטיאַל פּאַסיק זענען יקסקלודיד פון די אַנאַליסיס.די קאַטאָף געניצט איז <104 פאָטאָנס פֿאַר ראַפץ און דאַץ און 103 פֿאַר טראפנס.די דראַפּלאַץ האָבן אַ נידעריקער שוועל ווייַל עס איז שווער צו באַקומען פאַרפוילן קורוועס מיט העכער ינטענסיטי וואַלועס, ווייַל די דראַפּלאַץ אין די בילד פעלד זענען יוזשאַוואַלי קלענערער און ווייניקער סך.ROIs מיט פאָטאָן קאַונץ העכער די פאָטאָן אַקיומיאַליישאַן שיעור (באַשטעטיקט צו> 500 קאַונץ / פּיקסעל) זענען אויך אַוועקגענומען פֿאַר אַנאַליסיס.גלייַכן די ינטענסיטי פאַרפוילן ויסבייג באקומען פון דער געגנט פון אינטערעס מיט אַ ינטענסיטי ביי 90% פון די מאַקסימום (אַ ביסל נאָך די מאַקסימום ינטענסיטי פון די פאַרפוילן) פֿון די אָנהייב פון די דינסט לעבן צו ענשור מינימאַל ינטערפיראַנס פון IRF און האַלטן די זעלבע פֿאַר אַלע ינטענסיטי פאַרפוילן רעלאַטיוו צייט פֿענצטער זענען אַנאַלייזד 25-50 ROI פֿאַר ראַפץ און ספּאַץ און 15-25 ROI פֿאַר טראפנס, בילדער אויסגעקליבן פון מער ווי 4 רעפּלאַקאַז רעקאָרדעד פון לפּחות 3 פרייַ יקספּעראַמאַנץ.צוויי-טיילד ה-טעסטס זענען געניצט צו אָפּשאַצן סטאַטיסטיש דיפעראַנסיז צווישן מינים אָדער צווישן קאָאַסערוואַט סיסטעמען.פֿאַר אַ פּיקסעל-דורך-פּיקסעל אַנאַליסיס פון די לעבן (τ), די גאַנץ אַטטענואַטיאָן פון די לעבן איבער די פעלד פֿאַר יעדער קאַנאַל איז קאַלקיאַלייטיד און אַ דערנענטערנ זיך פון אַ 2/3-קאָמפּאָנענט עקספּאָונענשאַל אַטטענואַטיאָן מאָדעל איז דורכגעקאָכט.די לעבן אַטטענואַטיאָן פֿאַר יעדער פּיקסעל איז געווען פיטאַד מיט פריער קאַלקיאַלייטיד τ וואַלועס, ריזאַלטינג אין אַ פּסעוודאָקאָלאָר FLIM פּאַסיק בילד.די עק-פּאַסיק לעבן קייט איז געווען די זעלבע איבער אַלע בילדער פון דער זעלביקער קאַנאַל, און יעדער פאַרפוילן געשאפן גענוג פאָטאָנס צו צושטעלן אַ פאַרלאָזלעך פּאַסיק.פֿאַר FRET אַנאַליסיס, בילדצעלן זענען אויסגעקליבן דורך אַפּלייינג אַ נידעריקער ינטענסיטי שוועל פון 100 פאָטאָנס, וואָס אַוורידזשד אַ הינטערגרונט סיגנאַל (FBG) פון 11 פאָטאָנס.די פלואָרעססענסע ינטענסיטי פון יעדער קאַנאַל איז קערעקטאַד דורך יקספּערמענאַלי באשלאסן קערעקשאַן סיבות: 69 ספּעקטראַל קראָססטאַלק α איז געווען 0.004, דירעקט עקסייטיישאַן β איז געווען 0.0305, דיטעקשאַן עפעקטיווקייַט γ איז געווען 0.517.די FRET עפעקטיווקייַט אויף די פּיקסעל מדרגה איז קאַלקיאַלייטיד מיט די פאלגענדע יקווייזשאַן:
ווו FDD איז די פלואָרעססענסע ינטענסיטי באמערקט אין די מענאַדעוו (גרין) קאַנאַל, FDA איז די פלואָרעססענסע ינטענסיטי באמערקט אין די אַקסעפּטאָר (רויט) קאַנאַל אונטער ומדירעקט עקסייטיישאַן, און FAA איז די פלואָרעססענסע ינטענסיטי באמערקט אין די אַקסעפּטאָר (רויט) קאַנאַל אונטער דירעקט עקסייטיישאַן ( PIE).פלואָרעססענסע ינטענסיטי פּאַלסיז זענען באמערקט אין דעם קאַנאַל).
שטעלן 100 μל פון LLPS רעאַקציע סאַלושאַנז מיט 25 μM אַנלייבאַלד מאָנאָמעריק טאַו441 (מיט אָדער אָן 25 μM αS) אין LLPS באַפער (סאַפּלאַמענטאַד ווי אויבן) אויף ניט-ביינדינג 96-געזונט מיקראָפּלאַטעס מיט קלעפּיק שטער קאָוטינג און דראַפּלאַט פאָרמירונג איז אָפּגעשטעלט דורך WF מיקראָסקאָפּי. יקוואַליבריישאַן.ין 10 מין.נאָך 48 שעה פון ינגקיוביישאַן אין צימער טעמפּעראַטור, די בייַזייַן פון פּראָטעין ראַפץ און ספּאַץ איז באשטעטיקט.דעמאָלט קערפאַלי באַזייַטיקן די פליסיק איבער די ראַפץ פון די וועלז, און לייגן 50 ל פון דיססאָסיאַטיאָן באַפער (10 מם העפּעס, ף 7.4, 1 ם נאַקל, 1 מם דטט) און ינגקיובייט פֿאַר 10 מינוט.די הויך זאַלץ קאַנסאַנטריישאַן ינשורז אַז LLPS וועט נישט איבערחזרן רעכט צו ריזידזשואַל PEG, און מעגלעך פּראָטעין אַסעמבליז געשאפן בלויז דורך ילעקטראָוסטאַטיק ינטעראַקשאַנז וועט זיין דיסאַסעמבאַלד.די דנאָ פון די געזונט איז געווען קערפאַלי סקריפּט אַוועק מיט אַ מיקראָפּיפּעטטע שפּיץ און די ריזאַלטינג לייזונג איז טראַנספערד צו אַ ליידיק אָבסערוואַציע געזונט.נאָך ינגקיוביישאַן פון די סאַמפּאַלז מיט 50 μM ThT פֿאַר 1 שעה, די בייַזייַן פון אפגעזונדערט ספּאַץ איז אָפּגעשטעלט דורך WF מיקראָסקאָפּי.צוגרייטן סאָניקאַטעד αS פיברילז דורך ינקובאַטינג 300 μל פון אַ 70-μM αS לייזונג אין פּבס מיט ף 7.4, סאָדיום אַזידע 0.01% ביי 37 ° C און 200 רפּם אויף אַן אָרבאַטאַל שייקער פֿאַר 7 טעג.דער לייזונג איז געווען סענטריפוגדעד בייַ 9600 × ג פֿאַר 30 מינוט, די שרייטל איז ריסאַספּאַנדיד אין PBS pH 7.4 און סאָניקאַטעד (1 מין, 50% ציקל, 80% אַמפּליטוד אין אַ וויבראַ-צעל ווק130 סאָניקאַטאָר, סאָניקס, Newton, USA) פיבריל סאַמפּאַלז מיט אַ לעפיערעך מונדיר גרייס פאַרשפּרייטונג פון קליין פיברילז.
FCS / FCCS אַנאַליסיס און צוויי-קאָליר צופאַל דיטעקשאַן (TCCD) זענען דורכגעקאָכט אויף דער זעלביקער MT200 צייט-סאַלווד פלורעסאַנט קאָנפאָקאַל מיקראָסקאָפּ (Pico-Quant, בערלין, דייַטשלאַנד) געניצט פֿאַר די FLIM-FRET מיקראָסקאָפּי יקספּעראַמאַנץ ניצן די PIE מאָדע.די לאַזער מאַכט פֿאַר די יקספּעראַמאַנץ איז צוגעגעבן צו 6.0 μW (481 נם) און 6.2 μW (637 nm).די קאָמבינאַציע פון די לאַזער כוחות איז אויסדערוויילט צו פּראָדוצירן ענלעך ברייטנאַס פֿאַר די פּערז פון פלואָראָפאָרעס געניצט בשעת אַטשיווינג אָפּטימאַל ציילן רייץ און ויסמיידן פאָטאָבלעאַטשינג און זעטיקונג.ביידע דאַטן זאַמלונג און אַנאַליסיס זענען דורכגעקאָכט מיט די קאמערשעל בנימצא SymphoTime64 ווערסיע 2.3 ווייכווארג (PicoQuant, בערלין, דייַטשלאַנד).
סאַמפּאַלז פון אפגעזונדערט αS / Tau אַגגרעגאַץ באקומען מיט LLPS זענען דיילוטאַד אין אפגעזונדערטקייט באַפער צו די צונעמען מאָנאָמאָלעקולאַר קאַנסאַנטריישאַן (טיפּיקלי אַ 1:500 דיילושאַן, ווייַל אַגגרעגאַץ זענען שוין ביי נידעריק קאַנסאַנטריישאַנז ווען ייסאַלייטאַד פון קאָאַסערוואַט סאַמפּאַלז).סאַמפּאַלז זענען געווענדט גלייַך צו קאָווערסליפּס (קאָרנינג, USA) פּרעקאָאַטעד מיט אַ BSA לייזונג אין אַ קאַנסאַנטריישאַן פון 1 מג / מל.
פֿאַר די PIE-smFRET אַנאַליסיס אין די גרין און רויט טשאַנאַלז, אַ נידעריקער ינטענסיטי שוועל פון 25 פאָטאָנס איז געווען געווענדט צו פילטער נידעריק ינטענסיטי סיגנאַלז געפֿירט דורך מאָנאָמעריק געשעענישן (באַמערקונג אַז מאָנאָמערז זענען מער ווי אַגגרעגאַטעד סאַמפּאַלז קאַמפּערד מיט אפגעזונדערט אַגגרעגאַץ).דער שוועל איז קאַלקיאַלייטיד ווי פינף מאל די דורכשניטלעך ינטענסיטי פון מאָנאָמעריק αS באקומען פון די אַנאַליסיס פון ריין מאָנאָמער סאַמפּאַלז אין סדר צו ספּעסיפיקאַללי אויסקלייַבן אַגגרעגאַץ פֿאַר אַנאַליסיס.די PIE פאָר קרייַז, צוזאַמען מיט TSCPC דאַטן אַקוואַזישאַן, האט ענייבאַלד די אַפּלאַקיישאַן פון אַ לעבן ווייטינג פילטער וואָס העלפּס עלימינירן הינטערגרונט און ספּעקטראַל קראָססטאַלק.די פלער ינטענסיטי אויסגעקליבן מיט די אויבן טרעשכאָולדז איז קערעקטאַד מיט די דורכשניטלעך הינטערגרונט סיגנאַל באשלאסן פֿון די כיסטאַגראַמז פון פּאַסירונג קעגן ינטענסיטי / בין פון די באַפער-בלויז סאַמפּאַלז.בערסץ פֿאַרבונדן מיט גרויס אַגגרעגאַץ טיפּיקלי פאַרנעמען עטלעכע קאָנסעקוטיווע בינס אין די צייט שפּור (שטעלן צו 1 מיז).אין די קאַסעס, אַ באַן פון מאַקסימום שטאַרקייַט איז אויסדערוויילט.פֿאַר FRET און סטאָיטשיאָמעטריק אַנאַליסיס, די טעאָרעטיש באשלאסן גאַמאַ פאַקטאָר γ (0.517) איז געניצט.ספּעקטראַל קראָססטאַלק און דירעקט עקסייטיישאַן קאַנטראַביושאַנז זענען נעגלאַדזשאַבאַל (באשלאסן יקספּערמענאַלי) ביי די עקסייטיישאַן לאַזער מאַכט געניצט.די עפעקטיווקייַט און סטאָיטשיאָמעטרי פון FRET אין אַ יקספּלאָוזשאַן איז קאַלקיאַלייטיד ווי גייט.
פּאָסטן צייט: מערץ 08-2023