דאנק איר פֿאַר באזוכן Nature.com.איר נוצן אַ בלעטערער ווערסיע מיט לימיטעד CSS שטיצן.פֿאַר דער בעסטער דערפאַרונג, מיר רעקאָמענדירן אַז איר נוצן אַ דערהייַנטיקט בלעטערער (אָדער דיסייבאַל קאַמפּאַטאַבילאַטי מאָדע אין Internet Explorer).אין אַדישאַן, צו ענשור אָנגאָינג שטיצן, מיר ווייַזן דעם פּלאַץ אָן סטיילז און דזשאַוואַסקריפּט.
סלידערס וואָס ווייַזן דריי אַרטיקלען פּער רוק.ניצן די צוריק און ווייַטער קנעפּלעך צו מאַך דורך די סליידז, אָדער די רוק קאָנטראָללער קנעפּלעך אין די סוף צו מאַך דורך יעדער רוק.

317 ומבאַפלעקט שטאָל שפּול טובינג סאַפּלייערז

כעמישער זאַץ טיש פון ומבאַפלעקט שטאָל מאַטעריאַל

SPACA6 איז אַ זיירע-אויסגעדריקט ייבערפלאַך פּראָטעין וואָס איז קריטיש פֿאַר גאַמעטע פוסיאָן בעשאַס מאַממאַליאַן געשלעכט רעפּראָדוקציע.טראָץ דעם פונדאַמענטאַל ראָלע, די ספּעציפיש פונקציע פון ​​SPACA6 איז שוואַך פארשטאנען.מיר דערקלערן די קריסטאַל סטרוקטור פון די עקסטראַסעללולאַר פעלד פון SPACA6 אין אַ האַכלאָטע פון ​​2.2 Å, ריווילינג אַ צוויי-פעלד פּראָטעין קאַמפּאָוזד פון אַ פיר-סטראַנדיד פּעקל און יג-ווי β-סאַנדוויטשיז דזשוינד דורך קוואַזי-פלעקסאַבאַל לינקערס.די סטרוקטור ריזעמבאַלז IZUMO1, אן אנדער גאַמעטע פוסיאָן-פֿאַרבונדן פּראָטעין, וואָס מאכט SPACA6 און IZUMO1 ערשטן מיטגלידער פון די סופּערפאַמילי פון פערטאַליזיישאַן-פֿאַרבונדן פּראָטעינס ריפערד צו דערין ווי די IST סופּערפאַמילי.די IST סופּערפאַמילי איז סטראַקטשעראַלי דיפיינד דורך זיין טוויסטיד פיר-העליקס פּעקל און אַ פּאָר פון דיסולפידע-לינגקט CXXC מאָוטיפס.א סטרוקטור-באזירט AlphaFold זוכן פון די מענטשלעך פּראָטעאָמע יידענאַפייד נאָך פּראָטעין מיטגלידער פון דעם סופּערפאַמילי;נאָוטאַבלי, פילע פון ​​די פּראָטעינס זענען ינוואַלווד אין גאַמעטע פוסיאָן.די SPACA6 סטרוקטור און זיין שייכות צו אנדערע מיטגלידער פון די IST סופּערפאַמילי צושטעלן די פעלנדיק לינק אין אונדזער וויסן פון מאַממאַליאַן גאַמעטע פוסיאָן.
יעדער מענטש לעבן הייבט זיך אָן מיט צוויי באַזונדער האַפּלאָיד גאַמעטעס: די פאטער 'ס זיירע און די מוטער' ס יי.דער זיירע איז דער געווינער פון אַן אינטענסיווע סעלעקציע פּראָצעס בעשאַס וואָס מיליאַנז פון זיירע סעלז פאָרן דורך די ווייַבלעך דזשענאַטאַל שעטעך, באַקומען פאַרשידן מניעות1 און אַנדערגאָו קאַפּאַסיטיישאַן, וואָס ימפּרוווז זייער מאָוטיליטי און דער פּראָצעס פון ייבערפלאַך קאַמפּאָונאַנץ2,3,4.אפילו אויב די זיירע און אָאָסיטע געפֿינען זיך, דער פּראָצעס איז נישט איבער נאָך.די אָאָסיטע איז סעראַונדאַד דורך אַ פּלאַסט פון קומולוס סעלז און אַ גלייקפּראָטעין באַריער גערופן די זאָנאַ פּעללוסידאַ, דורך וואָס זיירע מוזן פאָרן צו אַרייַן די אָאָסיטע.ספּערמאַטאָזאָאַ נוצן אַ קאָמבינאַציע פון ​​ייבערפלאַך אַדכיזשאַן מאַלאַקיולז און מעמבראַנע-פארבונדן און סעקרעטעד ענזימעס צו באַקומען די לעצט באַריערז.די מאַלאַקיולז און ענזימעס זענען דער הויפּט סטאָרד אין די ינער מעמבראַנע און אַקראָסאָמאַל מאַטריץ און זענען דיטעקטאַד ווען די ויסווייניקסט מעמבראַנע פון ​​די זיירע איז ליסעד בעשאַס די אַקראָסאָמאַל רעאַקציע.די לעצט שריט אין דעם טיף נסיעה איז די זיירע-יי פוסיאָן געשעעניש, אין וואָס די צוויי סעלז פוסע זייער מעמבריינז צו ווערן אַ איין דיפּלאָיד אָרגאַניזם7.כאָטש דעם פּראָצעס איז גראַונדברייקינג אין מענטש רעפּראָדוקציע, די נייטיק מאָלעקולאַר ינטעראַקשאַנז זענען שוואַך פארשטאנען.
אין אַדישאַן צו דער פערטאַליזיישאַן פון גאַמעטעס, די כעמיע פון ​​די פוסיאָן פון צוויי ליפּיד בילייַערס איז יקסטענסיוולי געלערנט.אין אַלגעמיין, מעמבראַנע פוסיאָן איז אַן ענערגעטיק אַנפייוועראַבאַל פּראָצעס וואָס ריקווייערז אַ פּראָטעין קאַטאַליסט צו אַנדערגאָו אַ סטראַקטשעראַל קאַנפאָרמיישאַן ענדערונג וואָס ברענגט צוויי מעמבריינז נעענטער צוזאַמען, ברייקינג זייער קאַנטיניויישאַן און פאַרשאַפן פוסיאָן8,9.די פּראָטעין קאַטאַליסץ זענען באקאנט ווי פוסאָגענס און האָבן שוין געפֿונען אין קאַונטלאַס פוסיאָן סיסטעמען.זיי זענען פארלאנגט פֿאַר וויראַל אַרייַנטרעטן אין באַלעבאָס סעלז (למשל, gp160 אין היוו-1, ספּייק אין קאָראָנאַווירוסעס, העמאַגלוטינין אין ינפלוענציע ווירוסעס) 10,11,12 פּלאַסענטאַל (סינסיטין) 13,14,15 און גאַמעטע-פאָרמינג פיוזשאַנז אין נידעריקער עוקאַריאָטעס ( HAP2/GCS1 אין געוויקסן, פּראָטיסץ און אַרטראַפּאָדס) 16,17,18,19.פוסאָגענס פֿאַר מענטשלעך גאַמעטעס האָבן נאָך צו זיין דיסקאַווערד, כאָטש עטלעכע פּראָטעינס האָבן שוין געוויזן צו זיין קריטיש פֿאַר גאַמעטע אַטאַטשמאַנט און פוסיאָן.די אָאָסיטע-אויסגעדריקט CD9, אַ טראַנסמעמבראַנע פּראָטעין פארלאנגט פֿאַר די פוסיאָן פון מויז און מענטש גאַמעטעס, איז געווען דער ערשטער צו זיין דיסקאַווערד 21,22,23.כאָטש זייַן גענוי פונקציע בלייבט ומקלאָר, אַ ראָלע אין אַדכיזשאַן, די סטרוקטור פון אַדכיזשאַן פאָסי אויף יי מיקראָוויללי און / אָדער די ריכטיק לאָוקאַלאַזיישאַן פון אָאָסיטע ייבערפלאַך פּראָטעינס מיינט מסתּמא 24,25,26.די צוויי מערסט טיפּיש פּראָטעינס וואָס זענען קריטיש פֿאַר גאַמעטע פוסיאָן זענען די זיירע פּראָטעין IZUMO127 און די אָאָסיטע פּראָטעין JUNO28, און זייער קעגנצייַטיק פאַרבאַנד איז אַ וויכטיק שריט אין גאַמעטע דערקענונג און אַדכיזשאַן איידער פוסיאָן.זכר Izumo1 נאַקאַוט מיסע און ווייַבלעך דזשונאָ נאַקאַוט מיסע זענען גאָר סטערילע, אין די מאָדעלס זיירע אַרייַן די פּעריוויטעלליין פּלאַץ אָבער גאַמעטעס טאָן ניט פוסע.סימילאַרלי, קאַנפלואַנס איז רידוסט ווען גאַמעטעס זענען באהאנדלט מיט אַנטי-IZUMO1 אָדער JUNO27,29 אַנטיבאָדיעס אין מענטשלעך אין וויטראָ פערטאַליזיישאַן יקספּעראַמאַנץ.
לעצטנס, אַ ניי דיסקאַווערד גרופּע פון ​​זיירע-אויסגעדריקט פּראָטעינס פענאָטיפּיקאַללי ענלעך צו IZUMO1 און JUNO20,30,31,32,33,34,35 איז דיסקאַווערד.זיירע אַקראָסאָמאַל מעמבראַנע-פֿאַרבונדן פּראָטעין 6 (SPACA6) איז יידענאַפייד ווי יקערדיק פֿאַר פערטאַליזיישאַן אין אַ גרויס-וואָג מיורינע מיוטאַגענעס לערנען.ינסערשאַן פון די טראַנסגענע אין די ספּאַקאַ 6 דזשין טראגט ניט-פוסיבלע ספּערמאַטאָזאָאַ, כאָטש די ספּערמאַטאָזאָאַ ינפילטרירן די פּעריוויטעלינע פּלאַץ 36.סאַבסאַקוואַנט נאַקאַוט שטודיום אין מיסע באשטעטיקט אַז ספּאַקאַ 6 איז פארלאנגט פֿאַר גאַמעטע פוסיאָן 30,32.SPACA6 איז אויסגעדריקט כּמעט אויסשליסלעך אין די טעסץ און האט אַ לאָוקאַלאַזיישאַן מוסטער ענלעך צו די פון IZUMO1, ניימלי אין די ינטימאַ פון די ספּערמאַטאָזאָאַ איידער די אַקראָסאָמאַל אָפּרוף, און דעמאָלט מייגרייט צו די עקוואַטאָריאַל געגנט נאָך די אַקראָסאָמאַל אָפּרוף 30,32.ספּאַקאַ6 האָמאָלאָגועס עקסיסטירן אין אַ פאַרשיידנקייַט פון מאַמאַלז און אנדערע עוקאַריאָטעס 30 און זייַן וויכטיקייט פֿאַר מענטש גאַמעטע פוסיאָן איז דעמאַנסטרייטיד דורך ינאַבישאַן פון מענטש פערטאַליזיישאַן אין וויטראָ דורך קעגנשטעל צו SPACA6 30.ניט ענלעך IZUMO1 און JUNO, די דעטאַילס פון די סטרוקטור, ינטעראַקשאַנז און פונקציע פון ​​SPACA6 בלייבן ומקלאָר.
צו בעסער פֿאַרשטיין די פונדאַמענטאַל פּראָצעס אונטער די פוסיאָן פון מענטשלעך זיירע און עגגס, וואָס וועט געבן אונדז צו מיטטיילן צוקונפֿט דיוועלאַפּמאַנץ אין משפּחה פּלאַנירונג און גיביקייַט באַהאַנדלונג, מיר געפירט SPACA6 סטראַקטשעראַל און בייאָוקעמיקאַל שטודיום.די קריסטאַל סטרוקטור פון די עקסטראַסעללולאַר פעלד פון SPACA6 ווייזט אַ פיר-כעליקאַל פּעקל (4HB) און אַ ימיונאָגלאָבולין-ווי (יג-ווי) פעלד פארבונדן דורך קוואַזי-פלעקסאַבאַל מקומות.ווי פּרעדיקטעד אין פריערדיקן שטודיום, 7,32,37, די פעלד סטרוקטור פון SPACA6 איז ענלעך צו די פון מענטשלעך IZUMO1, און די צוויי פּראָטעינס טיילן אַ ומגעוויינטלעך מאָטיוו: 4HB מיט אַ טרייאַנגגיאַלער כעליקאַל ייבערפלאַך און אַ פּאָר פון דיסולפידע-לינגקט CXXC מאָוטיפס.מיר פאָרשלאָגן אַז IZUMO1 און SPACA6 איצט דעפינירן אַ גרעסערע, סטראַקטשעראַלי פֿאַרבונדענע סופּערפאַמילי פון פּראָטעינס פֿאַרבונדן מיט גאַמעטע פוסיאָן.ניצן פֿעיִקייטן יינציק צו די סופּערפאַמילי, מיר דורכגעקאָכט אַ יגזאָסטיוו זוכן פֿאַר די אַלפאַפאָלד סטראַקטשעראַל מענטש פּראָטעאָמע, יידענאַפייד נאָך מיטגלידער פון דעם סופּערפאַמילי, אַרייַנגערעכנט עטלעכע מיטגלידער ינוואַלווד אין גאַמעטע פוסיאָן און / אָדער פערטאַליזיישאַן.עס איצט אויס אַז עס איז אַ פּראָסט סטראַקטשעראַל פאַרלייגן און סופּערפאַמילי פון פּראָטעינס פֿאַרבונדן מיט גאַמעטע פוסיאָן, און אונדזער סטרוקטור גיט אַ מאָלעקולאַר מאַפּע פון ​​דעם וויכטיק אַספּעקט פון די מענטשלעך גאַמעטע פוסיאָן מעקאַניזאַם.
SPACA6 איז אַ איין-פאָרן טראַנסמעמבראַנע פּראָטעין מיט איין N-לינגקט גלייקאַן און זעקס פּאָטאַטיווע דיסולפידע קייטן (פיגורעס S1a און S2).מיר אויסגעדריקט די עקסטראַסעללולאַר פעלד פון מענטשלעך SPACA6 (רעזאַדז 27-246) אין Drosophila S2 סעלז און פּיוראַפייד די פּראָטעין ניצן ניקאַל קירבות, קאַטיאָן וועקסל און גרייס יקסקלוזשאַן קראָומאַטאַגראַפי (Fig. S1b).די פּיוראַפייד SPACA6 עקטאָדאָמאַין איז זייער סטאַביל און כאָומאַדזשיניאַס.אַנאַליסיס ניצן גרייס יקסקלוזשאַן קראָומאַטאַגראַפי קאַמביינד מיט פּאָליגאָנאַל ליכט צעוואָרפן (סעק-מאַלס) גילוי איין שפּיץ מיט אַ קאַלקיאַלייטיד מאָלעקולאַר וואָג פון 26.2 ± 0.5 קדאַ (Fig. S1c).דאָס איז קאָנסיסטענט מיט די גרייס פון די SPACA6 מאָנאָמעריק עקטאָדאָמאַין, וואָס ינדיקייץ אַז אָליגאָמעריזיישאַן איז נישט געשען בעשאַס רייניקונג.אין דערצו, קייַלעכיק דיטשראָיסם (סי) ספּעקטראָסקאָפּי אנטפלעקט אַ געמישט α / β סטרוקטור מיט אַ מעלטינג פונט פון 51.3 ° C (Fig. S1d, E).דעקאָנוואָלוטיאָן פון די סי ספּעקטראַ אנטפלעקט 38.6% α-העליקאַל און 15.8% β-סטראַנדיד עלעמענטן (פיגורע S1d).
די SPACA6 עקטאָדאָמאַין איז געווען קריסטאַלייזד ניצן טראַפ מאַטריץ סעדינג 38 ריזאַלטינג אין אַ דאַטן שטעלן מיט אַ האַכלאָטע פון ​​2.2 Å (טאַבלע 1 און פיגורע ס 3).ניצן אַ קאָמבינאַציע פון ​​​​פראַגמענט-באזירט מאָלעקולאַר סאַבסטיטושאַן און סאַד פייזינג דאַטן מיט בראָומייד ויסשטעלן פֿאַר סטרוקטור פעסטקייַט (טאַבלע 1 און פיגורע ס 4), די לעצט ראַפינירט מאָדעל באשטייט פון רעזאַדוז 27-246.אין דער צייט וואָס די סטרוקטור איז באשלאסן, עס זענען געווען קיין יקספּערמענאַל אָדער AlphaFold סטראַקטשערז בנימצא.די SPACA6 עקטאָדאָמאַין מיטלען 20 Å × 20 Å × 85 Å, באשטייט פון זיבן העליס און נייַן β-סטראַנדז, און האט אַ ילאָנגגייטאַד טערשערי פאַרלייגן סטייבאַלייזד דורך זעקס דיסולפידע קייטן (Fig. 1 אַ, ב).די שוואַך עלעקטראָן געדיכטקייַט אין די סוף פון די Asn243 זייַט קייט ינדיקייץ אַז די רעזאַדו איז אַן N-לינגקט גלייקאַסיליישאַן.די סטרוקטור באשטייט פון צוויי דאָומיינז: אַ N-וואָקזאַל פיר-העליקס פּעקל (4HB) און אַ C-וואָקזאַל יג-ווי פעלד מיט אַ ינטערמידייט הינגע געגנט צווישן זיי (Fig. 1c).
אַ סטרוקטור פון די עקסטראַסעללולאַר פעלד פון SPACA6.פּאַס דיאַגראַמע פון ​​די עקסטראַסעללולאַר פעלד פון SPACA6, די קאָליר פון די קייט פון N צו C-טערמינוס פון טונקל בלוי צו טונקל רויט.סיסטעינז ינוואַלווד אין דיסולפידע קייטן זענען כיילייטיד אין מאַגענטאַ.ב טאַפּאָלאָגי פון די עקסטראַסעללולאַר פעלד פון SPACA6.ניצן די זעלבע קאָליר סכעמע ווי אין פיגורע 1אַ.c SPACA6 עקסטראַסעללולאַר פעלד.די 4HB, הינגע און Ig-ווי פעלד פּאַס טשאַרץ זענען ריספּעקטיוולי בונט מאַראַנץ, גרין און בלוי.די לייַערס זענען נישט ציען צו וואָג.
די 4HB פעלד פון SPACA6 כולל פיר הויפּט העליסעס (העליקס 1-4), וואָס זענען עריינדזשד אין די פאָרעם פון אַ כעליקאַל כיליקס (Fig. 2 אַ), אָלטערנייטינג צווישן אַנטיפּאַראַלעל און פּאַראַלעל ינטעראַקשאַנז (Fig. 2b).א קליין נאָך איין-דרייַ כיליקס (העליקס 1′) איז געלייגט פּערפּענדיקולאַר צו דעם פּעקל, פאָרמינג אַ דרייַעק מיט העליסעס 1 און 2. דעם דרייַעק איז אַ ביסל דיפאָרמד אין די כעליקאַל-טוויסטעד פּאַקינג פון די לעפיערעך געדיכט פּאַקינג פון העליסעס 3 און 4 ( פייג 2 א).
4HB N-וואָקזאַל פּאַס טשאַרט.ב שפּיץ מיינונג פון אַ פּעקל פון פיר העליסעס, יעדער כיליקס כיילייטיד אין טונקל בלוי אין די N-טערמינוס און טונקל רויט אין די C-טערמינוס.c שפּיץ-אַראָפּ ספּיראַליש ראָד דיאַגראַמע פֿאַר 4HB, מיט יעדער רעזאַדו געוויזן ווי אַ קרייַז מיט אַ איין-בריוו אַמינאָ זויער קאָד;בלויז די פיר אַמינאָ אַסאַדז אין די שפּיץ פון די ראָד זענען געציילט.ניט-פּאָליאַר רעזאַדוז זענען בונט געל, פּאָליאַר אַנטשאַרדזשד רעזאַדוז זענען בונט גרין, דורכויס טשאַרדזשינג רעזאַדוז זענען בונט בלוי, און נעגאַטיוו טשאַרדזשינג רעזאַדוז זענען בונט רויט.ד טרייאַנגגיאַלער פנימער פון די 4HB פעלד, מיט 4HBs אין מאַראַנץ און כינדזשיז אין גרין.ביידע ינסעץ ווייַזן רוט-שייפּט דיסולפידע קייטן.
4HB איז קאַנסאַנטרייטאַד אויף אַ ינער הידראָפאָביק האַרץ קאַמפּאָוזד דער הויפּט פון אַלפאַטיק און עראַמאַטיק רעזאַדוז (Fig. 2c).די האַרץ כּולל אַ דיסולפידע בונד צווישן סיס41 און סיס55 וואָס פֿאַרבינדט העליסעס 1 און 2 צוזאַמען אין אַן אויבערשטער אויפשטיין דרייַעק (פיגורע 2ד).צוויי נאָך דיסולפידע קייטן זענען געשאפן צווישן די קקסקס מאָטיף אין כיליקס 1′ און אן אנדער קקסקס מאָטיף געפֿונען אין די שפּיץ פון די β-האַירפּין אין די הינגע געגנט (Fig. 2 ד).א קאָנסערוואַטיווע אַרגינינע רעזאַדו מיט אַן אומבאַקאַנט פֿונקציע (אַרג37) איז ליגן ין אַ פּוסט דרייַעק געשאפן דורך העליסעס 1′, 1, און 2. אַלפאַטיק טשאַד אַטאָמס Cβ, Cγ, און Cδ Arg37 ינטעראַקט מיט די כיידראָופאָביק האַרץ, און זייַן גואַנידינע גרופּעס סיקליקלי מאַך צווישן העליס 1′ און 1 דורך ינטעראַקשאַנז צווישן די Thr32 באַקבאָון און זייַט קייט (Fig. S5a,b).טיר34 יקסטענדז אין די קאַוואַטי און לאָזן צוויי קליין קאַוויטיז דורך וואָס Arg37 קענען ינטעראַקט מיט די סאַלוואַנט.
יג-ווי β-סענדוויטש דאָומיינז זענען אַ גרויס סופּערפאַמילי פון פּראָטעינס וואָס טיילן די פּראָסט שטריך פון צוויי אָדער מער מאַלטי-סטראַנדיד אַמפיפּאַטהיק β-שיץ ינטעראַקטינג דורך אַ כיידראָופאָביק האַרץ 39. די C-וואָקזאַל יג-ווי פעלד פון SPACA6 האט די זעלבע מוסטער און באשטייט פון צוויי לייַערס (Fig. S6a).בויגן 1 איז אַ β-בלאַט פון פיר סטראַנדז (סטראַנדז D, F, H, און I) ווו סטראַנדז F, H, און I פאָרעם אַן אַנטי-פּאַראַלעל אָרדענונג, און סטראַנדז I און D נעמען אַ פּאַראַלעל ינטעראַקשאַן.טיש 2 איז אַ קליין אַנטי-פּאַראַלעל טאָפּל-סטראַנדיד ביתא בלאַט (סטראַנדז E און G).אַ ינערלעך דיסולפידע בונד איז באמערקט צווישן די C-טערמינוס פון די E קייט און די צענטער פון די ה קייט (סיס170-סיס226) (פיג. ס6ב).דער דיסולפידע בונד איז ענלעכער צו די דיסולפידע בונד אין די β-סענדוויטש פעלד פון ימיונאָגלאָבולין40,41.
די פיר-שנירל β-בלאַט טוויסץ צוזאמען זייַן גאנצע לענג, פאָרמינג אַסיממעטריק עדזשאַז וואָס אַנדערש זייַן אין פאָרעם און עלעקטראָסטאַטיקס.די טינער ברעג איז אַ פלאַך הידראָפאָביק ינווייראַנמענאַל ייבערפלאַך וואָס שטייט אויס קאַמפּערד מיט די רוען אַניוואַן און עלעקטראָסטאַטיקאַללי דייווערס סערפאַסיז אין SPACA6 (Fig. S6b, C).א האַלאָ פון יקספּאָוזד באַקבאָון קאַרבאָניל / אַמינאָ גרופּעס און פּאָליאַר זייַט קייטן סעראַונדז די כיידראָפאָביק ייבערפלאַך (Fig. S6c).די ברייט גרענעץ איז באדעקט דורך אַ קאַפּט כעליקאַל אָפּשניט וואָס בלאַקס די N-וואָקזאַל חלק פון די כיידראָופאָביק האַרץ און פארמען דרייַ הידראָפאָביק קייטן מיט די עפענען פּאָליאַר גרופּע פון ​​די F קייט באַקבאָון (Fig. S6d).די C-וואָקזאַל חלק פון דעם ברעג פארמען אַ גרויס קעשענע מיט אַ טייל יקספּאָוזד כיידראָופאָביק האַרץ.די קעשענע איז סעראַונדאַד דורך positive טשאַרדזשיז רעכט צו דריי שטעלט פון טאָפּל אַרגינינע רעזאַדוז (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 און Arg212-Arg214) און אַ הויפט היסטידינע (His220) (פיגורע S6e).
די הינגע געגנט איז אַ קורץ אָפּשניט צווישן די כעליקאַל פעלד און די יג-ווי פעלד, קאַנסיסטינג פון איין אַנטיפּאַראַלעל דריי-סטראַנדיד β-שיכטע (סטראַנדז א, ב און C), אַ קליין 310 כיליקס, און עטלעכע לאַנג טראַפ כעליקאַל סעגמאַנץ.(פיג. ס 7).א נעץ פון קאָוואַלענט און ילעקטראָוסטאַטיק קאָנטאַקטן אין די הינגע געגנט איז צו סטייבאַלייז די אָריענטירונג צווישן 4HB און די Ig-ווי פעלד.די נעץ קענען זיין צעטיילט אין דרייַ טיילן.דער ערשטער טייל ינקלודז צוויי CXXC מאָוטיפס (27CXXC30 און 139CXXC142) וואָס פאָרעם אַ פּאָר פון דיסולפידע קייטן צווישן די β-האַירפּין אין די הינגע און די 1′ כיליקס אין 4HB.די רגע טייל כולל ילעקטראָוסטאַטיק ינטעראַקשאַנז צווישן די יג-ווי פעלד און די הינגע.Glu132 אין די הינגע פארמען אַ זאַלץ בריק מיט Arg233 אין די יג-ווי פעלד און Arg135 אין די הינגע.דער דריט טייל כולל אַ קאָוואַלענט בונד צווישן די יג-ווי פעלד און די הינגע געגנט.צוויי דיסולפידע קייטן (Cys124-Cys147 און Cys128-Cys153) פאַרבינדן די הינגע שלייף צו אַ לינקער וואָס איז סטייבאַלייזד דורך ילעקטראָוסטאַטיק ינטעראַקשאַנז צווישן Gln131 און די באַקבאָון פאַנגקשאַנאַל גרופּע, אַלאַוינג אַקסעס צו דער ערשטער Ig-ווי פעלד.קייט.
די סטרוקטור פון די SPACA6 עקטאָדאָמאַין און יחיד סטראַקטשערז פון 4HB און Ig-ווי דאָומיינז זענען געניצט צו זוכן פֿאַר סטראַקטשעראַלי ענלעך רעקאָרדס אין פּראָטעין דאַטאַבייסיז 42.מיר יידענאַפייד שוועבעלעך מיט הויך דאַלי ז סקאָרז, קליין נאָרמאַל דיווייישאַנז און גרויס LALI סקאָרז (די יענער איז די נומער פון סטראַקטשעראַלי עקוויוואַלענט רעזאַדוז).בשעת די ערשטער 10 היץ פון די פול עקטאָמאַין זוכן (טאַבלע ס 1) האט אַ פּאַסיק ז כעזשבן פון> 842, אַ זוכן פֿאַר 4HB אָדער Ig-ווי פעלד אַליין געוויזן אַז רובֿ פון די היץ קאָראַספּאַנדז בלויז צו β-סאַנדוויטשיז.אַ ומעטומיק פאַרלייגן געפונען אין פילע פּראָטעינס.אַלע דריי אָנפֿרעגן אין דאַלי האָבן בלויז איין רעזולטאַט: IZUMO1.
עס איז לאַנג געווען סאַגדזשעסטיד אַז SPACA6 און IZUMO1 טיילן סטראַקטשעראַל סימאַלעראַטיז 7,32,37.כאָטש די עקטאָדאָמאַינס פון די צוויי גאַמעטע פוסיאָן-פֿאַרבונדן פּראָטעינס טיילן בלויז 21% סיקוואַנס אידענטיטעט (פיגורע S8a), קאָמפּלעקס זאָגן, אַרייַנגערעכנט אַ קאַנסערווד דיסולפידע בונד מוסטער און אַ פּרעדיקטעד C-וואָקזאַל יג-ווי פעלד אין SPACA6, ערלויבט פרי פרווון צו בויען אַ האָמאָלאָגי מאָדעל פון A אַ SPACA6 מויז ניצן IZUMO1 ווי אַ טעמפּלאַטע37.אונדזער סטרוקטור קאַנפערמז די פֿאָרויסזאָגן און ווייַזן די אמת גראַד פון ענלעכקייט.אין פאַקט, די SPACA6 און IZUMO137,43,44 סטראַקטשערז טיילן די זעלבע צוויי-פעלד אַרקאַטעקטשער (Fig. S8b) מיט ענלעך 4HB און Ig-ווי β-סענדוויטש דאָומיינז פארבונדן דורך אַ הינגע געגנט (Fig. S8c).
IZUMO1 און SPACA6 4HB האָבן פּראָסט דיפעראַנסיז פון קאַנווענשאַנאַל ספּיראַליש באַנדאַלז.טיפּיש 4HBs, ווי די געפונען אין SNARE פּראָטעין קאַמפּלעקסאַז ינוואַלווד אין ענדאָסאָמאַל פוסיאָן 45,46, האָבן יוואַנלי ספּייסט העליסעס וואָס האַלטן אַ קעסיידערדיק קערוואַטשער אַרום אַ הויפט אַקס 47. אין קאַנטראַסט, די כעליקאַל דאָומיינז אין ביידע IZUMO1 און SPACA6 זענען פאַרקרימט, מיט וועריאַבאַל קערוואַטשער און אַניוואַן פּאַקינג (פיגורע ס8ד).די טוויסט, מיסטאָמע געפֿירט דורך די דרייַעק געשאפן דורך העליסעס 1′, 1 און 2, איז ריטיינד אין IZUMO1 און SPACA6 און סטייבאַלייזד דורך דער זעלביקער CXXC מאָטיף אויף כיליקס 1′.אָבער, די נאָך דיסולפידע בונד געפֿונען אין SPACA6 (Cys41 און Cys55 קאָוואַלענטלי פֿאַרבינדונג העליסעס 1 און 2 אויבן) קריייץ אַ שאַרפּער שפּיץ אין די דרייַעק שפּיץ, וואָס מאכט SPACA6 מער טוויסטיד ווי IZUMO1, מיט מער פּראַנאַונסט קאַוואַטי טריאַנגלעס.אין אַדישאַן, IZUMO1 פעלן Arg37 באמערקט אין דעם צענטער פון דעם קאַוואַטי אין SPACA6.אין קאַנטראַסט, IZUMO1 האט אַ מער טיפּיש כיידראָופאָביק האַרץ פון אַלפאַטיק און עראַמאַטיק רעזאַדוז.
IZUMO1 האט אַן יג-ווי פעלד קאַנסיסטינג פון אַ טאָפּל-סטראַנדיד און פינף-סטראַנדיד β-שעט43.די עקסטרע שנירל אין IZUMO1 ריפּלייסיז די שפּול אין SPACA6, וואָס ינטעראַקץ מיט די F שנירל צו באַגרענעצן באַקבאָון הידראָגען קייטן אין די שנירל.אַ טשיקאַווע פונט פון פאַרגלייַך איז די פּרעדיקטעד ייבערפלאַך אָפּצאָל פון די יג-ווי דאָומיינז פון די צוויי פּראָטעינס.די IZUMO1 ייבערפלאַך איז מער נעגאַטיוולי טשאַרדזשינג ווי די SPACA6 ייבערפלאַך.אַן נאָך אָפּצאָל איז ליגן לעבן די C-טערמינוס פייסינג די זיירע מעמבראַנע.אין SPACA6, די זעלבע מקומות זענען מער נייטראַל אָדער דורכויס באפוילן (Fig. S8e).פֿאַר בייַשפּיל, די כיידראָופאָביק ייבערפלאַך (טינער עדזשאַז) און דורכויס טשאַרדזשינג פּיץ (ברייט עדזשאַז) אין SPACA6 זענען נעגאַטיוולי טשאַרדזשינג אין IZUMO1.
כאָטש די שייכות און צווייטיק סטרוקטור עלעמענטן צווישן IZUMO1 און SPACA6 זענען געזונט אפגעהיט, די סטראַקטשעראַל אַליינמאַנט פון די יג-ווי דאָומיינז געוויזן אַז די צוויי דאָומיינז זענען אַנדערש אין זייער אַלגעמיין אָריענטירונג קאָרעוו צו יעדער אנדערער (Fig. S9).די ספּיראַליש פּעקל פון IZUMO1 איז קערווד וועגן די β-סענדוויטש, קריייטינג די פריער דיסקרייבד "בומעראַנג" פאָרעם אין וועגן 50 ° פון די הויפט אַקס.אין קאַנטראַסט, די כעליקאַל שטראַל אין SPACA6 איז טילטיד וועגן 10 ° אין די פאַרקערט ריכטונג.די דיפעראַנסיז אין די אָריענטיישאַנז זענען מסתּמא רעכט צו דיפעראַנסיז אין די הינגע געגנט.אין די ערשטיק סיקוואַנס מדרגה, IZUMO1 און SPACA6 טיילן קליין סיקוואַנס ענלעכקייט ביי די הינגע, מיט די ויסנעם פון סיסטינע, גלייסין און אַספּאַרטיק זויער רעזאַדוז.ווי אַ רעזולטאַט, הידראָגען קייטן און ילעקטראָוסטאַטיק נעטוואָרקס זענען גאָר אַנדערש.β-בלאַט צווייטיק סטרוקטור עלעמענטן זענען שערד דורך IZUMO1 און SPACA6, כאָטש די קייטן אין IZUMO1 זענען פיל מער און די 310 כיליקס (העליקס 5) איז יינציק צו SPACA6.די דיפעראַנסיז רעזולטאַט אין פאַרשידענע פעלד אָריענטיישאַנז פֿאַר צוויי אַנדערש ענלעך פּראָטעינס.
אונדזער דאַלי סערווער זוכן אנטפלעקט אַז SPACA6 און IZUMO1 זענען די בלויז צוויי יקספּערמענאַלי באשלאסן סטראַקטשערז סטאָרד אין די פּראָטעין דאַטאַבייס וואָס האָבן דעם באַזונדער 4HB פאַרלייגן (טאַבלע S1).מער לעצטנס, DeepMind (Alphabet / Google) האט דעוועלאָפּעד AlphaFold, אַ נעוראַל נעץ באזירט סיסטעם וואָס קענען אַקיעראַטלי פאָרויסזאָגן די 3 ד סטראַקטשערז פון פּראָטעינס פֿון ערשטיק סיקוואַנסיז48.באלד נאָך מיר סאַלווד די SPACA6 סטרוקטור, די AlphaFold דאַטאַבייס איז באפרייט, פּראַוויידינג פּרידיקטיוו סטרוקטור מאָדעלס קאַווערינג 98.5% פון אַלע פּראָטעינס אין די מענטשלעך פּראָטעאָמע48,49.ניצן אונדזער ריזאַלווד SPACA6 סטרוקטור ווי אַ זוכן מאָדעל, אַ סטראַקטשעראַל האָמאָלאָגי זוכן פֿאַר די מאָדעל אין די AlphaFold מענטש פּראָטעאָמע יידענאַפייד קאַנדאַדייץ מיט מעגלעך סטראַקטשעראַל סימאַלעראַטיז צו SPACA6 און IZUMO1.געגעבן די גלייבן אַקיעראַסי פון AlphaFold אין פּרידיקטינג SPACA6 (Fig. S10a) - ספּעציעל די 1.1 Å rms עקטאָמאַין קאַמפּערד מיט אונדזער ריזאַלווד סטרוקטור (Fig. S10b) - מיר קענען זיין זיכער אַז די יידענאַפייד SPACA6 שוועבעלעך זענען מסתּמא צו זיין פּינטלעך.
ביז אַהער, PSI-BLAST געזוכט די IZUMO1 קנויל מיט דריי אנדערע זיירע-פארבונדן פּראָטעינס: IZUMO2, IZUMO3 און IZUMO450.AlphaFold פּרעדיקטעד אַז די IZUMO משפּחה פּראָטעינס פאַרלייגן אין די 4HB פעלד מיט דער זעלביקער דיסולפידע בונד מוסטער ווי IZUMO1 (Figures 3a און S11), כאָטש זיי פעלן אַן יג-ווי פעלד.עס איז כייפּאַטאַסייזד אַז IZUMO2 און IZUMO3 זענען איין-סיידיד מעמבראַנע פּראָטעינס ענלעך צו IZUMO1, בשעת IZUMO4 איז סאַקריטאַד.די פאַנגקשאַנז פון IZUMO 2, 3 און 4 פּראָטעינס אין גאַמעטע פוסיאָן זענען נישט באשלאסן.IZUMO3 איז באַוווסט צו שפּילן אַ ראָלע אין אַקראָסאָמע ביאָגענעסיס בעשאַס די אַנטוויקלונג פון ספּערמאַטאָזאָאַ 51, און די IZUMO פּראָטעין פארמען אַ קאָמפּלעקס 50.די קאַנסערוויישאַן פון IZUMO פּראָטעינס אין מאַמאַלז, רעפּטיילז און אַמפיביאַנס סאַגדזשעסץ אַז זייער פּאָטענציעל פונקציע איז קאָנסיסטענט מיט די פון אנדערע באַוווסט גאַמעטע-פוסיאָן פּראָטעינס, אַזאַ ווי DCST1/2, SOF1 און FIMP.
דיאַגראַמע פון ​​די פעלד אַרקאַטעקטשער פון די IST סופּערפאַמילי, מיט 4HB, הינגע און Ig-ווי דאָומיינז כיילייטיד אין מאַראַנץ, גרין און בלוי ריספּעקטיוולי.IZUMO4 האט אַ יינציק C-וואָקזאַל געגנט וואָס קוקט שוואַרץ.באשטעטיקט און פּאָטאַטיווע דיסולפידע קייטן זענען געוויזן דורך האַרט און דאַטיד שורות, ריספּעקטיוולי.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYLpha 8-F95), (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) זענען געוויזן אין דער זעלביקער קאָליר קייט ווי טאַפליע א. דיסולפידע קייטן זענען געוויזן אין מאַגענטאַ.TMEM95, IZUMO2 און IZUMO3 טראַנסמעמבראַנע העליס זענען נישט געוויזן.
ניט ענלעך די IZUMO פּראָטעין, אנדערע SPACA פּראָטעינס (ד"ה SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 און SPACA9) זענען געדאַנק צו זיין סטראַקטשעראַלי אַנדערש פון SPACA6 (Fig. S12).בלויז SPACA9 האט 4HB, אָבער עס איז נישט דערוואַרט צו האָבן די זעלבע פּאַראַלעל-אַנטי-פּאַראַלעל אָריענטירונג אָדער די זעלבע דיסולפידע בונד ווי SPACA6.בלויז SPACA1 האט אַ ענלעך Ig-ווי פעלד.AlphaFold פּרידיקס אַז SPACA3, SPACA4 און SPACA5 האָבן אַ גאָר אַנדערש סטרוקטור ווי SPACA6.ינטערעסטינגלי, SPACA4 איז אויך באַוווסט צו שפּילן אַ ראָלע אין פערטאַליזיישאַן, אָבער אין אַ גרעסערע מאָס ווי SPACA6, אַנשטאָט פאַסילאַטייט די ינטעראַקשאַן צווישן זיירע און אָאָסיטע זאָנאַ pellucida52.
אונדזער AlphaFold זוכן געפֿונען אן אנדער גלייַכן פֿאַר IZUMO1 און SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, אַ איין זיירע-ספּעציפיש טראַנסמעמבראַנע פּראָטעין, רענדערז זכר מיסע ינפערטיל ווען אַבלייטיד 32,33.ספּערמאַטאָזאָאַ פעלנדיק TMEM95 האט נאָרמאַל מאָרפאָלאָגי, מאָוטיליטי און די פיייקייט צו דורכנעמען די זאָנאַ פּעללוסידאַ און בינדן צו די יי מעמבראַנע, אָבער קען נישט פיוס מיט די אָאָסיטע מעמבראַנע.פריער שטודיום האָבן געוויזן אַז TMEM95 שאַרעס סטראַקטשעראַל סימאַלעראַטיז מיט IZUMO133.טאקע, די AlphaFold מאָדעל באשטעטיקט אַז TMEM95 איז אַ 4HB מיט די זעלבע פּאָר פון CXXC מאָוטיפס ווי IZUMO1 און SPACA6 און דער זעלביקער נאָך דיסולפידע בונד צווישן העליס 1 און 2 געפֿונען אין SPACA6 (Fig. 3a און S11).כאָטש TMEM95 פעלן אַן יג-ווי פעלד, עס האט אַ געגנט מיט אַ דיסולפידע בונד מוסטער ענלעך צו די SPACA6 און IZUMO1 הינגע מקומות (Fig. 3b).אין דער צייט פון ארויסגעבן דעם מאַנוסקריפּט, די פּרעפּרינט סערווער האָט געמאלדן די סטרוקטור פון TMEM95, וואָס באשטעטיקט די AlphaFold53 רעזולטאַט.TMEM95 איז זייער ענלעך צו SPACA6 און IZUMO1 און איז עוואָלוטיאָנאַרי קאַנסערווד שוין אין אַמפיביאַנס (Fig. 4 און S13).
די PSI-BLAST זוכן געניצט די NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP און SOF1 דאַטאַבייסיז צו באַשטימען די שטעלע פון ​​די סיקוואַנסיז אין דעם בוים פון לעבן.דיסטאַנסאַז צווישן צווייַג ווייזט זענען נישט געוויזן צו וואָג.
די סטרייקינג קוילעלדיק סטראַקטשעראַל ענלעכקייט צווישן SPACA6 און IZUMO1 סאַגדזשעסץ אַז זיי זענען ערשטן מיטגלידער פון אַ קאַנסערווד סטראַקטשעראַל סופּערפאַמילי וואָס כולל די TMEM95 און IZUMO 2, 3 און 4 פּראָטעינס.באקאנט מיטגלידער: IZUMO1, SPACA6 און TMEM95.ווייַל בלויז אַ ביסל מיטגלידער פאַרמאָגן יג-ווי דאָומיינז, די כאַלמאַרק פון די IST סופּערפאַמילי איז די 4HB פעלד, וואָס האט יינציק פֿעיִקייטן פּראָסט צו אַלע די פּראָטעינס: 1) קוילד 4HB מיט העליס עריינדזשד אין אַן אַנטי-פּאַראַלעל / פּאַראַלעל אָלטערניישאַן (Fig. 5 אַ), 2) דער פּעקל האט אַ טרייאַנגגיאַלער פּנים וואָס באשטייט פון צוויי העליסעס אין דעם פּעקל און אַ דריט ווערטיקאַל כיליקס (פיגורע שליסל געגנט (פיגורע 5c). ווי אַ רעדאָקס סענסער 54,55,56, בשעת די מאָטיוו אין IST משפּחה מיטגלידער קענען זיין פארבונדן מיט פּראָטעין דיסולפידע יסאָמעראַסאַז אַזאַ ווי ERp57 אין גאַמעטע פוסיאָן.
מיטגלידער פון די IST סופּערפאַמילי זענען דיפיינד דורך דריי כאַראַקטעריסטיש פֿעיִקייטן פון די 4HB פעלד: פיר העליס אָלטערנייטינג צווישן פּאַראַלעל און אַנטיפּאַראַלעל אָריענטירונג, באַ-טרייאַנגגיאַלער כעליקאַל פּעקל פנימער, און אַ קאַ קקססק טאָפּל מאָטיוו געשאפן צווישן קליין מאַלאַקיולז.) ען-וואָקזאַל העליקס (מאַראַנץ) און הינגע געגנט β-האַירפּין (גרין).
געגעבן די ענלעכקייט צווישן SPACA6 און IZUMO1, די פיייקייט פון די ערשטע צו בינדן צו IZUMO1 אָדער JUNO איז טעסטעד.ביאָלייַער ינטערפעראָמעטרי (BLI) איז אַ קינעטיק-באזירט ביינדינג אופֿן וואָס איז ביז אַהער געניצט צו קוואַנטיפיצירן די ינטעראַקשאַן צווישן IZUMO1 און JUNO.נאָך ינגקיוביישאַן פון די ביאָטין-לייבאַלד סענסער מיט IZUMO1 ווי אַ לעקעכל מיט אַ הויך קאַנסאַנטריישאַן פון JUNO אַנאַליט, אַ שטאַרק סיגנאַל איז געווען דיטעקטאַד (Fig. S14a), ינדאַקייטינג אַ ביינדינג-ינדוסט ענדערונג אין די גרעב פון די ביאָמאַטעריאַל אַטאַטשט צו די סענסער שפּיץ.ענלעך סיגנאַלז (ד"ה דזשונאָ קאַפּאַלד צו די סענסער ווי אַ לעקעכל קעגן יזומאָ1 אַנאַליט) (פיגורע ס14ב).קיין סיגנאַל איז געווען דיטעקטאַד ווען SPACA6 איז געניצט ווי אַן אַנאַליט קעגן סענסער-געבונדן IZUMO1 אָדער סענסער-געבונדן JUNO (פיגורע S14a,b).דער אַוועק פון דעם סיגנאַל ינדיקייץ אַז די עקסטראַסעללולאַר פעלד פון SPACA6 טוט נישט ינטעראַקט מיט די עקסטראַסעללולאַר פעלד פון IZUMO1 אָדער JUNO.
ווייַל די BLI אַססייַ איז באזירט אויף ביאָטינילאַטיאָן פון פריי ליסין רעזאַדוז אויף די לעקעכל פּראָטעין, דעם מאָדיפיקאַטיאָן קענען פאַרמייַדן ביינדינג אויב ליסין רעזאַדוז זענען ינוואַלווד אין די ינטעראַקשאַן.אין אַדישאַן, די אָריענטירונג פון די ביינדינג קאָרעוו צו די סענסער קענען מאַכן סטעריק כינדראַנסיז, אַזוי קאַנווענשאַנאַל ציען-אַראָפּ אַסייסאַז זענען אויך דורכגעקאָכט אויף די רעקאָמבינאַנט ספּאַקאַ6, IZUMO1 און JUNO עקטאָדאָמאַינס.טראָץ דעם, SPACA6 האט נישט אָפּזאַץ מיט His-tagged IZUMO1 אָדער His-tagged JUNO (Fig. S14c, D), ינדאַקייטינג קיין ינטעראַקשאַן קאָנסיסטענט מיט אַז באמערקט אין BLI יקספּעראַמאַנץ.ווי אַ positive קאָנטראָל, מיר באשטעטיקט די ינטעראַקשאַן פון JUNO מיט Label His IZUMO1 (Figures S14e און S15).
טראָץ די סטראַקטשעראַל ענלעכקייט צווישן SPACA6 און IZUMO1, די ינאַביליטי פון SPACA6 צו בינדן JUNO איז נישט חידוש.די ייבערפלאַך פון מענטש IZUMO1 האט מער ווי 20 רעזאַדוז וואָס ינטעראַקט מיט JUNO, אַרייַנגערעכנט רעזאַדוז פון יעדער פון די דריי מקומות (כאָטש רובֿ פון זיי זענען ליגן אין די הינגע געגנט) (Fig. S14f).פון די רעזאַדוז, בלויז איינער איז קאַנסערווד אין SPACA6 (Glu70).בשעת פילע רעזאַדו סאַבסטיטיושאַנז ריטיינד זייער אָריגינעל בייאָוקעמיקאַל פּראָפּערטיעס, די יקערדיק Arg160 רעזאַדו אין IZUMO1 איז ריפּלייסט דורך די נעגאַטיוולי באפוילן Asp148 אין SPACA6;פריערדיקע שטודיום האָבן געוויזן אַז די Arg160Glu מיוטיישאַן אין IZUMO1 כּמעט גאָר אַבאַליסיז ביינדינג צו JUNO43.אין אַדישאַן, די חילוק אין פעלד אָריענטירונג צווישן IZUMO1 און SPACA6 באטייטיק געוואקסן די ייבערפלאַך שטח פון די JUNO-בינדינג פּלאַץ פון די עקוויוואַלענט געגנט אויף SPACA6 (Fig. S14g).
טראָץ די באַוווסט נויט פֿאַר SPACA6 פֿאַר גאַמעטע פוסיאָן און זיין ענלעכקייט צו IZUMO1, SPACA6 קען נישט האָבן אַן עקוויוואַלענט JUNO ביינדינג פונקציע.דעריבער, מיר האָבן געזוכט צו פאַרבינדן אונדזער סטראַקטשעראַל דאַטן מיט זאָגן פון וויכטיקייט צוגעשטעלט דורך עוואָלוטיאָנאַרי ביאָלאָגי.סיקוואַנס אַליינמאַנט פון SPACA6 האָמאָלאָגועס ווייַזן די קאַנסערוויישאַן פון דער פּראָסט סטרוקטור ווייַטער פון מאַמאַלז.פֿאַר בייַשפּיל, סיסטינע רעזאַדו זענען פאָרשטעלן אפילו אין ווייַט פֿאַרבונדענע אַמפיביאַנז (Fig. 6 אַ).ניצן די ConSurf סערווער, קייפל סיקוואַנס אַליינמאַנט ריטענשאַן דאַטן פון 66 סיקוואַנסיז זענען מאַפּט צו די SPACA6 ייבערפלאַך.דעם טיפּ פון אַנאַליסיס קענען ווייַזן וואָס רעזאַדוז זענען קאַנסערווד בעשאַס פּראָטעין עוואָלוציע און קענען אָנווייַזן וואָס ייבערפלאַך מקומות שפּילן אַ ראָלע אין פונקציע.
אַ סיקוואַנס אַליינמאַנט פון SPACA6 עקטאָדאָמיין פון 12 פאַרשידענע מינים צוגעגרייט מיט CLUSTAL OMEGA.לויט די ConSurf אַנאַליסיס, די מערסט קאָנסערוואַטיווע שטעלעס זענען אנגעצייכנט אין בלוי.סיסטינע רעזאַדו זענען כיילייטיד אין רויט.פעלד באַונדריז און צווייטיק סטרוקטור עלעמענטן זענען געוויזן אין די שפּיץ פון די אַליינמאַנט, ווו אַראָוז אָנווייַזן β-סטראַנדז און כוואליעס אָנווייַזן העליס.די NCBI אַקסעס אידענטיפיערס מיט די סיקוואַנסיז זענען: מענטש (Homo sapiens, NP_001303901), מאַנדריל (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), קאַפּוטשין מאַלפּע (Cebus mimic, XP_017359366), פערד (Equus caballus, XP60235, XP60235, XP60235, XP6023, Killer, XP6023, XP_01821277) 032_034) .), שעפּס (Ovis aries, XP_014955560), העלפאַנד (Loxodonta africana, XP_010585293), הונט (Canis lupus familyis, XP_025277208), מויז (Mus musculus, NP_001156381), טאַסמאַניאַן שטן 1, XP061156381, XP01156381, טאַסמאַניאַן שטן 1 ), פלאטיפוס, 8 ) , 61_89 און Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).די נומערינג איז באזירט אויף מענטש סדר.ב ייבערפלאַך פאַרטרעטונג פון די SPACA6 סטרוקטור מיט 4HB אין דער שפּיץ און יג-ווי פעלד אין די דנאָ, פארבן באזירט אויף קאַנסערוויישאַן עסטאַמאַץ פון די ConSurf סערווער.די בעסטער אפגעהיט טיילן זענען אין בלוי, די מאַדעראַטלי אפגעהיט זענען אין ווייַס, און די קלענסטער אפגעהיט זענען אין געל.לילאַ סיסטינע.דריי ייבערפלאַך פּאַטשאַז דעמאַנסטרייטינג אַ הויך מדרגה פון שוץ זענען געוויזן אין די ינסעט מיטן נאָמען פּאַטשאַז 1, 2 און 3. א 4HB קאַרטון איז געוויזן אין די ינסעט אין שפּיץ רעכט (זעלביקער קאָליר סכעמע).
די SPACA6 סטרוקטור האט דריי העכסט קאַנסערווד ייבערפלאַך מקומות (פיגורע 6ב).פּאַטש 1 ספּאַנס 4הב און די הינגע געגנט און כּולל צוויי קאַנסערווד קקסקסק דיסולפידע בריקן, אַ אַרג233-גלו132-אַרג135-סער144 הינגע נעץ (Fig. S7), און דריי קאַנסערווד ויסווייניקסט עראַמאַטיק רעזאַדוז (Phe31, Tyr73, Phe137)).אַ ברייט קאַנט פון די יג-ווי פעלד (Fig. S6e), וואָס רעפּראַזענץ עטלעכע דורכויס באפוילן רעזאַדוז אויף די זיירע ייבערפלאַך.ינטערעסטינגלי, דער לאַטע כּולל אַן אַנטיבאָדי עפּיטאָפּע וואָס איז פריער געוויזן צו אַרייַנמישנ זיך מיט SPACA6 30 פונקציע.געגנט 3 ספּאַנס די הינגע און איין זייַט פון די יג-ווי פעלד;דער געגנט כּולל קאַנסערווד פּראָלינעס (פּראָ126, פּראָ127, פּראָ150, פּראָ154) און אַוטווערד-פייסינג פּאָליאַר / באפוילן רעזאַדוז.סאַפּרייזינגלי, רובֿ פון די רעזאַדוז אויף די ייבערפלאַך פון 4HB זענען העכסט וועריאַבאַל (Fig. 6b), כאָטש די פאַרלייגן איז קאַנסערווד איבער די SPACA6 כאָומאַלאַדזשי (ווי אנגעוויזן דורך די קאָנסערוואַטיזאַם פון די כיידראָופאָביק פּעקל האַרץ) און ווייַטער פון די IST סופּערפאַמילי.
כאָטש דאָס איז דער קלענסטער געגנט אין SPACA6 מיט די פיינאַסט דיטעקטאַבאַל צווייטיק סטרוקטור עלעמענטן, פילע הינגע געגנט רעשטן (אַרייַנגערעכנט געגנט 3) זענען העכסט קאַנסערווד צווישן SPACA6 האָמאָלאָגועס, וואָס קען אָנווייַזן אַז די אָריענטירונג פון די כעליקאַל פּעקל און β-סענדוויטש פיעסעס אַ ראָלע.ווי אַ קאָנסערוואַטיווע.אָבער, טראָץ ברייט הידראָגען באַנדינג און ילעקטראָוסטאַטיק נעטוואָרקס אין די הינגע געגנט פון SPACA6 און IZUMO1, זאָגן פון ינטרינסיק בייגיקייַט קענען זיין געזען אין די אַליינמאַנט פון די קייפל ערלויבט סטראַקטשערז פון IZUMO137,43,44.די אַליינמאַנט פון די יחיד דאָומיינז אָוווערלאַפּט געזונט, אָבער די אָריענטירונג פון די דאָומיינז קאָרעוו צו יעדער אנדערער וועריד פון 50 ° צו 70 ° פון די הויפט אַקס (Fig. S16).צו פֿאַרשטיין די קאָנפאָרמאַטיאָן דינאַמיק פון SPACA6 אין לייזונג, SAXS יקספּעראַמאַנץ זענען דורכגעקאָכט (Fig. S17a, B).אַב ינישיאָו ריקאַנסטראַקשאַן פון די SPACA6 עקטאָדאָמאַין קאַנפאָרמד צו אַ רוט קריסטאַל סטרוקטור (Fig. S18), כאָטש די קראַטקי פּלאַנעווען געוויזן עטלעכע גראַד פון בייגיקייַט (Fig. S17b).די קאַנפאָרמיישאַן קאַנטראַסץ מיט IZUMO1, אין וואָס די אַנבאַונד פּראָטעין אַסומז אַ בומעראַנג פאָרעם ביידע אין די לאַטאַס און אין לייזונג43.
צו ספּאַסיפיקלי ידענטיפיצירן די פלעקסאַבאַל געגנט, הידראָגען-דעוטעריום וועקסל מאַסע ספּעקטראָסקאָפּי (H-DXMS) איז געווען דורכגעקאָכט אויף SPACA6 און קאַמפּערד מיט דאַטן ביז אַהער באקומען אויף IZUMO143 (Fig. 7 אַ, ב).SPACA6 איז קלאר מער פלעקסאַבאַל ווי IZUMO1, ווי אנגעוויזן דורך אַ העכער דעוטעריום וועקסל איבער די סטרוקטור נאָך 100,000 ס פון וועקסל.אין ביידע סטראַקטשערז, די C-וואָקזאַל טייל פון די הינגע געגנט ווייזט אַ הויך מדרגה פון וועקסל, וואָס מיסטאָמע אַלאַוז לימיטעד ראָוטיישאַן פון 4HB און Ig-ווי דאָומיינז קאָרעוו צו יעדער אנדערער.ינטערעסטינגלי, די C-וואָקזאַל טייל פון די SPACA6 הינגע, קאַנסיסטינג פון די 147CDLPLDCP154 רעזאַדו, איז אַ העכסט קאַנסערווד געגנט 3 (Fig. 6b), עפשער ינדיקייץ אַז ינטערדאָמאַין בייגיקייט איז אַן עוואָלוטיאָנאַרי קאַנסערווד שטריך פון SPACA6.לויט די בייגיקייט אַנאַליסיס, די טערמאַל צעשמעלצן דאַטן פון די סי האט געוויזן אַז SPACA6 (Tm = 51.2 ° C) איז ווייניקער סטאַביל ווי IZUMO1 (Tm = 62.9 ° C) (Fig. S1e און S19).
a H-DXMS בילדער פון SPACA6 און b IZUMO1.דער פּראָצענט דעוטעריום וועקסל איז באשלאסן אין די אנגעוויזן צייט פונקטן.לעוועלס פון הידראָגען-דעוטעריום וועקסל זענען אנגעוויזן דורך קאָליר אויף אַ גראַדיענט וואָג פון בלוי (10%) צו רויט (90%).שוואַרץ באָקסעס פאָרשטעלן געביטן פון הויך וועקסל.די באַונדריז פון 4HB, הינגע און Ig-ווי פעלד באמערקט אין די קריסטאַל סטרוקטור זענען געוויזן אויבן די ערשטיק סיקוואַנס.דעוטעריום וועקסל לעוועלס ביי 10 s, 1000 s און 100,000 s זענען פּלאַטיד אויף אַ פּאַס טשאַרט סופּעראַמפּאָוזד אויף די טראַנספּעראַנט מאָלעקולאַר סערפאַסיז פון SPACA6 און IZUMO1.פּאַרץ פון סטראַקטשערז מיט אַ דעוטעריום וועקסל מדרגה אונטער 50% זענען בונט ווייַס.געביטן העכער 50% H-DXMS וועקסל זענען בונט אין אַ גראַדיענט וואָג.
די נוצן פון CRISPR / Cas9 און מויז דזשין נאַקאַוט גענעטיק סטראַטעגיעס האט געפֿירט צו די לעגיטימאַציע פון ​​עטלעכע סיבות וויכטיק פֿאַר זיירע און יי ביינדינג און פוסיאָן.אַחוץ די געזונט קעראַקטערייזד ינטעראַקשאַן פון IZUMO1-JUNO און CD9 סטרוקטור, רובֿ פון די פּראָטעינס פֿאַרבונדן מיט גאַמעטע פוסיאָן בלייבן סטראַקטשעראַלי און פאַנגקשאַנאַלי עניגמאַטיק.די ביאָפיסיקאַל און סטראַקטשעראַל כאַראַקטעריזיישאַן פון SPACA6 איז אן אנדער טייל פון די אַדכיזשאַן / פוסיאָן מאָלעקולאַר רעטעניש בעשאַס פערטאַליזיישאַן.
SPACA6 און אנדערע מיטגלידער פון דער IST סופּערפאַמילי ויסקומען צו זיין העכסט קאַנסערווד אין מאַמאַלז ווי געזונט ווי יחיד פייגל, רעפּטיילז און אַמפיביאַנס;אין פאַקט, עס איז געדאַנק אַז SPACA6 איז אפילו פארלאנגט פֿאַר פערטאַליזיישאַן אין זעבראַפיש 59. די פאַרשפּרייטונג איז ענלעך צו אנדערע באַוווסט גאַמעטע פוסיאָן פּראָטעינס אַזאַ ווי DCST134, DCST234, FIMP31 און SOF132, סאַגדזשעסטינג אַז די סיבות זענען HAP2-דיפישאַנט (אויך) באקאנט ווי GCS1) פּראָטעינס וואָס זענען פאַראַנטוואָרטלעך פֿאַר די קאַטאַליטיק טעטיקייט פון פילע פּראָטיסץ., פלאנצן , או ן ארטראפאדז .פערטיליזעד פוסיאָן פּראָטעינס 60, 61. טראָץ די שטאַרק סטראַקטשעראַל ענלעכקייט צווישן SPACA6 און IZUMO1, נאַקאַוט פון גענעס וואָס קאָדירן איינער פון די פּראָטעינס ריזאַלטיד אין ינפערטיליטי אין זכר מיסע, וואָס ינדיקייץ אַז זייער פאַנגקשאַנז אין גאַמעטע פוסיאָן זענען נישט דופּליקייטיד..מער ברייט, גאָרניט פון די באַוווסט זיירע פּראָטעינס פארלאנגט פֿאַר די אַדכיזשאַן פאַסע פון ​​פוסיאָן איז יבעריק.
עס בלייבט אַן אָפֿן קשיא צי SPACA6 (און אנדערע מיטגלידער פון די IST סופּערפאַמילי) אָנטייל נעמען אין ינטערגאַמעטיק דזשונקטיאָנס, פאָרעם ינטראַגאַמעטיק נעטוואָרקס צו רעקרוט וויכטיק פּראָטעינס צו פוסיאָן פונקטן, אָדער טאָמער אפילו אַקט ווי ילוסיוו פוסאָגענס.קאָ-יממונאָפּרעסיפּיטאַטיאָן שטודיום אין HEK293T סעלז אנטפלעקט אַ ינטעראַקשאַן צווישן פול לענג IZUMO1 און SPACA632.אָבער, אונדזער רעקאָמבינאַנט עקטאָדאָמאַנז האָבן נישט ינטעראַקט אין וויטראָ, סאַגדזשעסטינג אַז די ינטעראַקשאַנז געזען אין Noda et al.זענען ביידע אויסגעמעקט אין די קאַנסטראַקשאַן (טאָן די סיטאָפּלאַסמיק עק פון IZUMO1, וואָס איז געוויזן צו זיין ומנייטיק פֿאַר פערטאַליזיישאַן62).אַלטערנאַטיוועלי, IZUMO1 און / אָדער SPACA6 קען דאַרפן ספּעציפיש ביינדינג ינווייראַנמאַנץ וואָס מיר טאָן ניט רעפּראָדוצירן אין וויטראָ, אַזאַ ווי פיזיאַלאַדזשיקלי ספּעציפיש קאַנפאָרמיישאַנז אָדער מאָלעקולאַר קאַמפּלעקסאַז מיט אנדערע פּראָטעינס (באקאנט אָדער נישט נאָך דיסקאַווערד).כאָטש די IZUMO1 עקטאָדאָמאַין איז געגלויבט צו פאַרמיידן אַטאַטשמאַנט פון ספּערמאַטאָזאָאַ צו די יי אין די פּעריוויטעללינע פּלאַץ, דער ציל פון די SPACA6 עקטאָדאָמאַין איז ומקלאָר.
די סטרוקטור פון SPACA6 ריווילז עטלעכע קאַנסערווד סערפאַסיז וואָס קען זיין ינוואַלווד אין פּראָטעין-פּראָטעין ינטעראַקשאַנז.די קאַנסערווד טייל פון די הינגע געגנט גלייך שכייניש צו די CXXC מאָטיף (דעזיגנייטיד פּאַטש 1 אויבן) האט עטלעכע אַוטווערד-פייסינג עראַמאַטיק רעזאַדוז וואָס זענען אָפט פארבונדן מיט כיידראָופאָביק און π-סטאַקינג ינטעראַקשאַנז צווישן ביאָמאָלעקולעס.די ברייט זייטן פון די יג-ווי פעלד (געגנט 2) פאָרעם אַ דורכויס באפוילן נאָרע מיט העכסט קאַנסערווד אַרג און זיין רעזאַדוז, און אַנטיבאָדיעס קעגן דעם געגנט זענען פריער געניצט צו פאַרשפּאַרן גאַמעטע פוסיאָן 30.דער אַנטיבאָדי אנערקענט די לינעאַר עפּיטאָופּ 212RIRPAQLTHRGTFS225, וואָס האט דריי פון די זעקס אַרגינינע רעזאַדוז און העכסט קאַנסערווד His220.עס איז נישט קלאָר צי די דיספאַנגקשאַן איז רעכט צו בלאַקידזש פון די ספּעציפיש רעזאַדוז אָדער די גאנצע געגנט.דער אָרט פון דעם ריס לעבן די C-טערמינוס פון די β-סענדוויטש ינדיקייץ סיס-ינטעראַקשאַנז מיט ארומיקע זיירע פּראָטעינס, אָבער נישט מיט אָאָסיטע פּראָטעינס.דערצו, די ריטענשאַן פון אַ העכסט פלעקסאַבאַל פּראָלינע-רייַך פּלאָנטערן (פּלאַץ 3) אין די הינגע קען זיין די פּלאַץ פון אַ פּראָטעין-פּראָטעין ינטעראַקשאַן אָדער, מער מסתּמא, אָנווייַזן די ריטענשאַן פון בייגיקייַט צווישן די צוויי דאָומיינז.דזשענדער איז וויכטיק פֿאַר די אומבאַקאַנט ראָלע פון ​​SPACA6.פוסיאָן פון גאַמעטעס.
SPACA6 האט פּראָפּערטיעס פון ינטערסעללולאַר אַדכיזשאַן פּראָטעינס, אַרייַנגערעכנט יג-ווי β-סאַנדוויטשיז.פילע קלעפּיק פּראָטעינס (למשל, קאַדהערינס, ינטעגרינס, אַדהעסינס און IZUMO1) פאַרמאָגן איינער אָדער מער β-סענדוויטש דאָומיינז וואָס פאַרברייטערן פּראָטעינס פון די צעל מעמבראַנע צו זייער ינווייראַנמענאַל טאַרגאַץ63,64,65.די Ig-ווי פעלד פון SPACA6 אויך כּולל אַ מאָטיוו וואָס איז אָפט געפֿונען אין β-סאַנדוויטשיז פון אַדכיזשאַן און קאָוכיזשאַן: דאַבאַלז פון פּאַראַלעל סטראַנדז אין די ענדס פון β-סאַנדוויטשיז, באקאנט ווי מעטשאַניקאַל קלאַמפּס66.עס איז געגלויבט אַז דעם מאָטיף ינקריסאַז קעגנשטעל צו שערן פאָרסעס, וואָס איז ווערטפול פֿאַר פּראָטעינס ינוואַלווד אין ינטערסעללולאַר ינטעראַקשאַנז.אָבער, טראָץ דעם ענלעכקייט צו אַדהעסינס, עס איז דערווייַל קיין זאָגן אַז SPACA6 ינטעראַקץ מיט יי ווייץ.די SPACA6 עקטאָדאָמאַין איז ניט ביכולת צו בינדן צו JUNO, און SPACA6-עקספּרעסינג HEK293T סעלז, ווי געוויזן דאָ, קוים ינטעראַקט מיט אָאָסיטעס פעלנדיק זאָנאַ 32.אויב SPACA6 טוט פאַרלייגן ינטערגאַמעטיק קייטן, די ינטעראַקשאַנז קען דאַרפן פּאָסט-טראַנסליישאַנאַל מאָדיפיקאַטיאָנס אָדער סטייבאַלאַזיישאַן דורך אנדערע זיירע פּראָטעינס.אין שטיצן פון די יענער כייפּאַטאַסאַס, IZUMO1-דיפישאַנט ספּערמאַטאָזאָאַ בינדן צו אָאָסיטעס, דעמאַנסטרייטינג אַז מאַלאַקיולז אנדערע ווי IZUMO1 זענען ינוואַלווד אין די גאַמעטע אַדכיזשאַן שריט 27.
פילע וויראַל, סעליאַלער און אַנטוויקלונג פוסיאָן פּראָטעינס האָבן פּראָפּערטיעס וואָס פאָרויסזאָגן זייער פונקציע ווי פוסאָגענס.פֿאַר בייַשפּיל, וויראַל פוסיאָן גלייקאָפּראָוטינז (קלאסן I, II און III) האָבן אַ כיידראָופאָביק פוסיאָן פּעפּטייד אָדער שלייף אין די סוף פון די פּראָטעין וואָס איז ינסערטאַד אין דער באַלעבאָס מעמבראַנע.די הידראָפיליסיטי מאַפּע פון ​​IZUMO143 און די סטרוקטור (באשלאסן און פּרעדיקטעד) פון די IST סופּערפאַמילי געוויזן קיין קלאָר כיידראָופאָביק פוסיאָן פּעפּטייד.אזוי, אויב פּראָטעינס אין די IST סופּערפאַמילי פונקציאָנירן ווי פוסאָגענס, זיי טאָן דאָס אין אַ שטייגער אַנדערש פון אנדערע באַוווסט ביישפילן.
אין מסקנא, די פאַנגקשאַנז פון די מיטגלידער פון די IST סופּערפאַמילי פון פּראָטעינס פֿאַרבונדן מיט גאַמעטע פוסיאָן בלייבן אַ טאַנטאַליזינג מיסטעריע.אונדזער קעראַקטערייזד SPACA6 רעקאָמבינאַנט מאַלאַקיול און זיין ריזאַלווד סטרוקטור וועט צושטעלן ינסייט אין די באציונגען צווישן די שערד סטראַקטשערז און זייער ראָלע אין גאַמעטע אַטאַטשמאַנט און פוסיאָן.
די דנאַ סיקוואַנס קאָראַספּאַנדינג צו די פּרעדיקטעד מענטשלעך SPACA6 עקטאָדאָמאַין (NCBI אַקסעשאַן נומער NP_001303901.1; רעזאַדוז 27-246) איז געווען קאָדאָן-אָפּטימיזעד פֿאַר אויסדרוק אין Drosophila melanogaster S2 סעלז און סינטאַסייזד ווי אַ דזשין פראַגמענט מיט די סיקוואַנס קאָדירונג פון Kozak (Eurofins Genomics)., די ביפּ ויסשיידונג סיגנאַל און די קאָראַספּאַנדינג 5′ און 3′ ענדס פֿאַר ליגאַטיאָן-פרייַ קלאָונינג פון דעם דזשין אין אַ פּמט אויסדרוק וועקטאָר באזירט אויף אַ מעטאַלאָטהיאָנעין פּראָמאָטער מאַדאַפייד פֿאַר סעלעקציע מיט פּוראָמיסין (pMT-puro).די pMT-puro וועקטאָר ענקאָוד אַ טהראָמבין קלעאַוואַגע פּלאַץ נאכגעגאנגען דורך אַ 10x-His C-וואָקזאַל קוויטל (פיגורע ס 2).
סטאַביל טראַנספעקשאַן פון די SPACA6 pMT-puro וועקטאָר אין D. melanogaster S2 (Gibco) סעלז איז דורכגעקאָכט סימאַלערלי צו די פּראָטאָקאָל געניצט פֿאַר IZUMO1 און JUNO43.S2 סעלז זענען טאָד און דערוואַקסן אין שניידער ס מיטל (Gibco) סאַפּלאַמענטאַד מיט אַ לעצט קאַנסאַנטריישאַן פון 10% (וו / וו) היץ-ינאַקטיווייטיד פעטאַל קאַלב סערום (Gibco) און 1X אַנטימיקאָטיק אַנטיביאָטיק (Gibco).פרי דורכפאָר סעלז (3.0 רענטגענ 106 סעלז) זענען פּלייטאַד אין יחיד וועלז פון 6-געזונט פּלאַטעס (קאָרנינג).נאָך 24 שעה פון ינגקיוביישאַן ביי 27 ° C, סעלז זענען טראַנספעקטעד מיט אַ געמיש פון 2 מג פון די SPACA6 pMT-puro וועקטאָר און Effectene טראַנספעקשאַן רייידזשאַנט (קיאַגען) לויט דער פּראָטאָקאָל פון דער פאַבריקאַנט.טראַנספעקטעד סעלז זענען ינגקיובייטיד פֿאַר 72 שעה און דעמאָלט כאַרוואַסטיד מיט 6 מג / מל פּוראָמיסין.סעלז זענען דעמאָלט אפגעזונדערט פון גאַנץ שניידער ס מיטל און געשטעלט אין סערום פריי ינסעקט-קספּרעסס מיטל (לאָנזאַ) פֿאַר גרויס וואָג פּראָטעין פּראָדוקציע.א 1 ל פּעקל פון S2 צעל קולטור איז געוואקסן צו 8-10 × 106 מל-1 סעלז אין אַ 2 ל ווענאַלייטיד פלאַך-באַטאַמד פּאַליפּראָופּאַלין ערלענמייער קאָלבע און דעמאָלט סטעראַלייזד מיט אַ לעצט קאַנסאַנטריישאַן פון 500 μM CuSO4 (Millipore Sigma) און סטערילע פילטערד.אריינגערעכנט.די ינדוסט קאַלטשערז זענען ינקובייטיד בייַ 27 ° סי ביי 120 רפּם פֿאַר פיר טעג.
קאַנדישאַנד מיטל מיט SPACA6 איז אפגעזונדערט דורך סענטריפוגיישאַן ביי 5660 × ג ביי 4 ° C נאכגעגאנגען דורך אַ Centramate טאַנגענטיאַל לויפן פילטריישאַן סיסטעם (Pall Corp) מיט אַ 10 kDa MWCO מעמבראַנע.צולייגן קאַנסאַנטרייטאַד מיטל מיט SPACA6 צו אַ 2 מל Ni-NTA אַגאַראָסע סמאָלע (קיאַגען) זייַל.די ני-נטאַ סמאָלע איז געוואשן מיט 10 זייַל וואַליומז (קוו) פון באַפער א און דעמאָלט 1 קוו פון באַפער א איז צוגעגעבן צו געבן אַ לעצט ימידאַזאָל קאַנסאַנטריישאַן פון 50 מם.SPACA6 איז געווען ילוטאַד מיט 10 מל פון באַפער א סאַפּלאַמענטאַד מיט ימידאַזאָלע צו אַ לעצט קאַנסאַנטריישאַן פון 500 מם.ריסטריקשאַן קלאַס טהראָמבין (מיליפּאָרע סיגמאַ) איז מוסיף גלייַך צו די דייאַליסיס טובינג (מווקאָ 12-14 קדאַ) ביי 1 אַפּאַראַט פּער מג ספּאַקאַ6 ווס 1 ל 10 מם טריס-הקל, ף 7.5 און 150 מם נאַקל (באַפער ב) פֿאַר דיאַליסיס.) בייַ 4 ° C פֿאַר 48 שעה.די טהראָמבין-קלעאַוועד SPACA6 איז דאַן דיילוטאַד דריי-פאַרלייגן צו רעדוצירן זאַלץ קאַנסאַנטריישאַן און לאָודיד אויף אַ 1 מל MonoS 5/50 GL קאַטיאָן וועקסל זייַל (Cytiva / GE) יקוואַליברייטיד מיט 10 מם טריס-הקל, pH 7.5.די קאַטיאָן יקסטשיינדזשער איז געוואשן מיט 3 OK 10 מם טריס-הקל, ף 7.5, דעמאָלט ספּאַקאַ 6 איז געווען ילוטאַד מיט אַ לינעאַר גראַדיענט פון 0 צו 500 מם נאַקל אין 10 מם טריס-הקל, ף 7.5 פֿאַר 25 OK.נאָך יאָן וועקסל קראָומאַטאַגראַפי, SPACA6 איז קאַנסאַנטרייטאַד צו 1 מל און ילוטאַד יסאָקראַטיש פון אַן ענריטש סעק650 10 קס 300 זייַל (ביאָראַד) יקוואַליברייטיד מיט באַפער בי לויט די קראָומאַטאַגראַם, בעקן און קאַנסאַנטרייט פראַקשאַנז מיט ספּאַקאַ6.ריינקייַט איז קאַנטראָולד דורך קאָאָמאַססיע-סטיינד עלעקטראָפאָרעסיס אויף אַ 16% סדס-פּאַליאַקרילאַמידע געל.פּראָטעין קאַנסאַנטריישאַן איז קוואַנטאַפייד דורך אַבזאָרבאַנס ביי 280 נם ניצן די באר-לאַמבערט געזעץ און די טעאָרעטיש מאָלאַר יקסטינגשאַן קאָואַפישאַנט.
פּיוראַפייד ספּאַקאַ 6 איז דייאַליייזד יבערנאַכטיק קעגן 10 מם סאָדיום פאָספאַטע, ף 7.4 און 150 מם נאַף און דיילוטאַד צו 0.16 מג / מל איידער אַנאַליסיס דורך סי ספּעקטראַסקאָפּי.ספּעקטראַל סקאַנינג פון קדס מיט אַ ווייוולענגט פון 185 צו 260 נם איז געזאמלט אויף אַ Jasco J-1500 ספּעקטראָפּאָלאַרימעטער ניצן קוואַרץ קווועטטעס מיט אַ 1 מם אָפּטיש דרך לענג (Helma) ביי 25 ° C מיט אַ קורס פון 50 נם / מין.די סי ספּעקטראַ זענען באַסעלינע קערעקטאַד, אַוורידזשד איבער 10 אַקוואַזישאַנז, און קאָנווערטעד צו מיינען ריזידזשואַל יליפּטאַסיטי (θMRE) אין דיגריז קמ2 / דמאָל:
ווו MW איז די מאָלעקולאַר וואָג פון יעדער מוסטער אין דאַ;ען איז די נומער פון אַמינאָ אַסאַדז;θ איז די יליפּטיקייט אין מיללידעגרעס;ד קאָראַספּאַנדז צו די לענג פון די אָפּטיש דרך אין סענטימעטער;פּראָטעין קאַנסאַנטריישאַן אין וניץ.