310 10 * 1 מם ומבאַפלעקט שטאָל קוילד טובינג כעמישער קאָמפּאָנענט, די N-וואָקזאַל דאָומיינז פון ספּידראָין פאָרעם כיידראָדזשאַלז באזירט אויף אַמילאָיד פיברילז און צושטעלן אַ פּלאַטפאָרמע פֿאַר פּראָטעין ימאָובאַלאַזיישאַן.

דאנק איר פֿאַר באזוכן Nature.com.איר נוצן אַ בלעטערער ווערסיע מיט לימיטעד CSS שטיצן.פֿאַר דער בעסטער דערפאַרונג, מיר רעקאָמענדירן אַז איר נוצן אַ דערהייַנטיקט בלעטערער (אָדער דיסייבאַל קאַמפּאַטאַבילאַטי מאָדע אין Internet Explorer).אין אַדישאַן, צו ענשור אָנגאָינג שטיצן, מיר ווייַזן דעם פּלאַץ אָן סטיילז און דזשאַוואַסקריפּט.
סלידערס וואָס ווייַזן דריי אַרטיקלען פּער רוק.ניצן די צוריק און ווייַטער קנעפּלעך צו מאַך דורך די סליידז, אָדער די רוק קאָנטראָללער קנעפּלעך אין די סוף צו מאַך דורך יעדער רוק.

ספּעציפיקאַציע

310 10 * 1 מם ומבאַפלעקט שטאָל קוילד טובינג סאַפּלייערז

כעמישער זאַץ

מעטשאַניקאַל פּראָפּערטיעס

רעקאָמבינאַנט שפּין זייַד פּראָטעינס (שפּין זייַד פּראָטעינס) האָבן פילע פּאָטענציעל אַפּלאַקיישאַנז אין דער אַנטוויקלונג פון נייַ ביאָמאַטיריאַליז, אָבער זייער מולטימאָדאַל און אַגגרעגאַטיאָן-פּראָנע נאַטור מאכט זיי שווער צו באַקומען און גרינג צו נוצן.דאָ מיר באַריכט אַז רעקאָמבינאַנט מיניאַטורע ספּידראָין פּראָטעינס און, ימפּאָרטאַנטלי, די N-וואָקזאַל פעלד (NT) זיך ראַפּאַדלי פאָרעם זיך-סופּפּאָרטינג און טראַנספּעראַנט הידראָגעלס ביי 37 °C.פוסיאָן פּראָטעינס קאַנסיסטינג פון NT און גרין פלורעסאַנט פּראָטעין אָדער פּורין נוקלעאָסידע פאָספאָרילאַסע פאָרעם גאָר פאַנגקשאַנאַל פוסיאָן פּראָטעינס.הידראָגעלס.אונדזער רעזולטאַטן ווייַזן אַז רעקאָמבינאַנט NT און פוסיאָן פּראָטעינס צושטעלן הויך אויסדרוק ייעלדס און געבן כיידראָדזשאַלז מיט אַטראַקטיוו פּראָפּערטיעס אַזאַ ווי דורכזעיקייַט, דזשעלאַטיאָן אָן קראָססלינקינג און דירעקט ימאָובאַלאַזיישאַן פון אַקטיוו פּראָטעינס מיט הויך געדיכטקייַט.
ספּיידערז האָבן ווי פילע ווי זיבן פאַרשידענע שטעלט פון זייַד גלאַנדז, יעדער פּראַדוסינג אַ ספּעציפיש טיפּ פון זייַד.אַלע זיבן זייַד מינים זענען פארפאסט פון שפּין זייַד פּראָטעינס (ספּידראָינס) בעערעך 6000 רעזאַדוז לאַנג און אַנטהאַלטן אַ גרויס הויפט איבערחזרן געגנט סעראַונדאַד דורך ספעריש N- און C-וואָקזאַל דאָומיינז (NT און CT) 1,2.די מערסט וויידלי געלערנט טיפּ פון זייַד, די ערשטיק אַמפּולאַ, איז געשאפן דורך די ערשטיק אַמפּולאַ דריז.אין דעם דריז, אַ מאָנאָלייַער פון עפּיטעליאַל סעלז סינטאַסייזיז ספּידראָין פּראָטעינס און סעקרעץ זיי אין די לומען פון די דריז, ווו זיי זענען פאָרשטעלן אין אַ סאַליאַבאַל פאָרעם (דאָפּינג) אין גאָר הויך קאַנסאַנטריישאַנז (30-50% וו / וו) 3,4.די אָרגאַניזאַציע און קאַנפאָרמיישאַן פון די הויפּט אַמפּולאַר ספּידראָין פּראָטעינס אין די דריז איז דעבאַטעד, אָבער רובֿ יקספּערמענאַל זאָגן ינדיקייץ די בייַזייַן פון אַ בכלל כעליקאַל און / אָדער טראַפ - כעליקאַל קאַנפאָרמיישאַן און מיסעללער אָדער לאַמעללאַר סטראַקטשערז 5,6,7,8,9,10.בשעת די ריפּעטיטיוו דאָומיינז רעגולירן מעטשאַניקאַל פּראָפּערטיעס פון זייַד פייבערז, פאָרמינג β-בלאַט נאַנאָקריסטאַלז און אַמאָרפאַס סטראַקטשערז 11,12,13,14,15, סוף דאָומיינז רעגולירן זייַד פייבערז אין ענטפער צו טשאַנגינג טנאָים צוזאמען די זייַד דריז 16,17,18.דורך קאַנטראָולינג זייַד פאָרמירונג, 19. טערמינאַל דאָומיינז זענען עוואָלוטיאָנאַרי קאַנסערווד און זייער פֿונקציע קען זיין פּראָסט פֿאַר אַלע ספּידראָין פּראָטעינס 2,20,21.בעשאַס דורכפאָר דורך די דריז, די ף פון ספּידראָין דיקריסאַז פון וועגן 7.6 צו <5.716 און ינקריסיז מיט שערן און אויסשטרעקן מידיייטיד דורך באַוועגונג דורך די ביסלעכווייַז נעראָוינג דאַקט.אין לייזונג, CT איז אַ α-העליקאַל קאַנסטאַטוטיוו פּאַראַלעל דימער17, אָבער אין ענטפער צו נידעריק ף און שערן פאָרסעס, קאָרט אַנפאָולדז און סוויטשיז β-לייַערס16, 17, עפשער טריגערינג β-לייַערס אין די ריפּעטיטיוו מקומות פון קאָנווערט 16. NT זענען מאָנאָמעריק אונטער טנאָים וואָס רעפלעקטירן טנאָים אין די לומען פון די דריז און פאַרמיטלען די סאָלוביליטי פון ספּידראָין, אָבער ביי רידוסט ף, פּראָטאָנאַטיאָן פון אַ נומער פון קאַרבאָקסיליק זויער זייַט קייטן פירט צו דימעריזיישאַן פון NT מיט אַ פּקאַ פון בעערעך 6.5, דערמיט סטייבאַלייזינג NT און פיקסיר ספּידראָין אין גרויס קוואַנטאַטיז.נעטוואָרקס16,18.אזוי, NT פיעסעס אַ שליסל ראָלע אין פאָדעם פאָרמירונג, טשאַנגינג פון אַ מאָנאָמער אין די קאָוטינג צו אַ דימער אין די פיברע23,24,25.NT בלייבט העכסט סאַליאַבאַל און כעליקאַל אונטער אַלע באדינגונגען געלערנט ביז אַהער 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, וואָס ינספּייערד זייַן אַנטוויקלונג ווי אַ סאָלוביליטי-ענכאַנסינג פירמע פֿאַר די פּראָדוקציע פון ​​כעטעראָלאָגיסט פּראָטעינס.
רעקאָמבינאַנט מיני שפּין זייַד פּראָטעין, וואָס באשטייט פון איין NT, איין קורץ איבערחזרן געגנט, איין CT און אַ His6 קוויטל (His-NT2RepCT) פֿאַר רייניקונג, איז ווי סאַליאַבאַל אין ייקוויאַס באַפער ווי געבוירן שפּין זייַד פּראָטעין און מימיקס געבוירן וויכטיק קעראַקטעריסטיקס פון זייַד שפּין. .קאַווערידזש 25.31.His-NT2RepCT קענען זיין ספּון אין קעסיידערדיק פייבערז ניצן אַ ביאַמימעטיק מאַשין אין וואָס אַ pH 8 סאַליאַבאַל קאָוטינג איז יקסטרודאַד אין אַ pH 525,32,33,34,35 וואַסער וואַנע.ביאָרעאַקטאָר פערמאַנטיישאַן פון E. קאָלי יקספּרעסינג His-NT2RepCT און סאַבסאַקוואַנט פּאָסטן-באַהאַנדלונג ריזאַלטיד אין> 14 ג / ל טראָגן נאָך רייניקונג.די הויך טראָגן, הויך סאָלוביליטי און טויגן ענטפער פון His-NT2RepCT צו אַסידיק טנאָים זענען אַלע אַטריביאַטאַד צו NT23, 25, 34.
דאָ מיר באַריכט די גיך פאָרמירונג פון טראַנספּעראַנט הידראָגעלס פון רעקאָמבינאַנט ספּידראָין פּראָטעינס, אַרייַנגערעכנט NT אַליין, דורך ינקובאַטינג אַ פּראָטעין לייזונג ביי 37 °C.מיט טהיאָפלאַווין ט פלואָרעססענסע (טהט), פאָוריער טראַנספאָרמאַציע ינפרערעד ספּעקטראַסקאָפּי (FTIR), יאָדער מאַגנעטיק אפקלאנג ספּעקטראַסקאָפּי (נמר) און טראַנסמיסיע עלעקטראָן מיקראָסקאָפּי (TEM), מיר געפֿונען אַז NT און מיקראָספּידער פּראָטעינס אַנדערגאָו סטראַקטשעראַל טראַנספאָרמאַציע אין β-שיץ און אַמילאָיד-ווי פיבראַלז. ווען דזשעלז זענען געשאפן.אין אַדישאַן, פוסיאָן פּראָטעינס פון NT און גרין פלורעסאַנט פּראָטעין (GFP) אָדער פּורינע נוקלעאָסידע פאָספאָרילאַסע (פּנפּ) פאָרעם כיידראָדזשאַלז מיט גאָר פאַנגקשאַנאַל פוסיאָן פראַגמאַנץ.הויך-טראַפּוט אויסדרוק אין כעטעראַלאַדזשיאַס מחנות, קאַפּאַלד מיט גיך פאָרמירונג פון הידראָגעלס אונטער פיזיאַלאַדזשיקאַל טנאָים, אָפּענס די מעגלעכקייט פון קאָס-עפעקטיוו פּראָדוקציע פון ​​כיידראָדזשאַלז מיט ענדזשאַנירד פאַנגקשאַנז.
ניט ענלעך רובֿ רעקאָמבינאַנט ספּידראָין פּראָטעינס36, His-NT2RepCT איז סטאַביל אין טריס-הקל באַפער ביי pH 8 און קענען זיין קאַנסאַנטרייטאַד אַרויף צו 500 מג / מל אָן אָפּזאַץ25.דעריבער, מיר זענען סאַפּרייזד צו געפֿינען אַז דעם פּראָטעין ראַפּאַדלי פארמען אָפּטיש קלאָר, זיך-סופּפּאָרטינג הידראָגעלס ווען ינגקיובייטיד בייַ 37 ° C (Fig. 1b-d).ווייַטער שטודיום געוויזן אַז His-NT2RepCT דזשעלאַטיאָן פארגעקומען איבער אַ ברייט קייט פון פּראָטעין קאַנסאַנטריישאַנז (10-300 מג / מל) און אַז די קאַנסאַנטריישאַן איז פאַרקערט קאָראַלייטאַד מיט דזשעלאַטיאָן צייט (Fig. 1c און Supplementary Fig. 1).צו געפֿינען אויס וואָס פּאַרץ פון His-NT2RepCT פאַרמיטלען הידראָגעל פאָרמירונג, מיר דאַן יגזאַמאַנד יעדער פעלד ינדיווידזשואַלי און אין פאַרשידן קאַמבאַניישאַנז ניצן אַ קאָלבע ינווערזשאַן אַסיי (פיגורע 1 אַ, ב).אַלע טעסטעד פראַקשאַנז פון רעקאָמבינאַנט ספּידראָין געשאפן דזשעלז (אין אַ פּראָטעין קאַנסאַנטריישאַן פון 300 מג / מל) אין ווייניקער ווי 1 ה, אַחוץ פֿאַר פּרעסיפּיטאַטעד 2 רעפּ (Fig. 1 ב).דאָס סאַגדזשעסץ אַז NT און CT אַליין, אין קאָמבינאַציע, אָדער פֿאַרבונדן מיט ריפּיץ, קענען געל ביי 37 ° C און אַז די His6 קוויטל קען נישט ווירקן דעם פּראָצעס אין קיין באַטייַטיק מאָס.געגעבן די פּראָסט געדאַנק אַז NT איז אַ העכסט סאַליאַבאַל און סטאַביל פּראָטעין, און אַז די פריערדיקע ריפּאָרץ פון רעקאָמבינאַנט ספּידראָין הידראָגעלס האָבן אַטריביאַטאַד דזשעלאַטיאָן יפעקץ צו קאַנפאָרמיישאַן ענדערונגען אין איבערחזרן מקומות און / אָדער קץ, NT זיך קען.די ופדעקונג פון דזשעלאַטיאָן איז געווען אומגעריכט.סופּפּלעמענטאַרי טאַבלע 1) 37, 38, 39. רימאַרקאַבלי, NT שוין געללד אין 10 מינוט אין אַ קאַנסאַנטריישאַן פון ≥ 300 מג / מל (Fig. 1 ק).וויאַל ינווערזשאַן יקספּעראַמאַנץ מיט פאַרשידן קאַנסאַנטריישאַנז פון NT געוויזן אַז ביי> 50 מג / מל די NT לייזונג געללד פאַסטער ווי His-NT2RepCT אין די קאָראַספּאַנדינג קאַנסאַנטריישאַן (וו / וו, פיגורע 1 ק).
סכעמאַטיש פאַרטרעטונג פון פאַרשידן ספּידראָין קאַנסטראַקשאַנז געלערנט אין דעם אַרבעט.ב געל צייט ביי 37 °C פֿאַר פאַרשידן רעקאָמבינאַנט ספּידראָין פּראָטעינס (300 מג / מל) וועראַפייד דורך ינווערטינג די וויאַל.קאָרט געל מיד אָן ינגקיוביישאַן (<300 מג / מל), 2 רעפּ פּרעסיפּיטאַטעס (300 מג / מל, 5 מם וואָג).c געל צייט פון His-NT2RepCT און NT ביי די אנגעוויזן פּראָטעין קאַנסאַנטריישאַנז ביי 37 °C.ד פאָטאָס פון His-NT2RepCT און NT הידראָגעלס מיט די שפּין און די בריוו "NT" געדרוקט אונטער, ריספּעקטיוולי (ביידע 200 מג / מל, וואָג באַר 5 מם).
הידראָגעלס געשאפן דורך פאַרשידן רעקאָמבינאַנט ספּידראָין פּראָטעינס האָבן אַ ביסל פאַרשידענע פארבן, און נאַקעט אויג אָבסערוואַציע ווייזט וועריינג דיגריז פון דורכזעיקייַט (Fig. 1b).NT דזשעלז זענען יקסעפּשנאַלי קלאָר בשעת אנדערע דזשעלז ווערן אָופּייק.זיין-NT2RepCT און NT דזשעלז וואַרפן אין סילינדריקאַל טובז קען זיין אַוועקגענומען פון די פורעם בעשאָלעם (Fig. 1d).
צו פּרובירן צי נאַטירלעך שפּין זייַד קאָאַטינגס געל אונטער טנאָים איצט געפונען צו פאַרשאַפן דזשעלאַטיאָן פון די רעקאָמבינאַנט ספּידראָין פּראָטעינס, קאָאַטינגס זענען געזאמלט פון די גרויס אַמפּולאַ דריז פון די שוועדיש בריק שפּין (Larinioides sclopetarius).קאָאַטינגס זענען סטאָרד אין 20 מם טריס-הקל באַפער ביי 50 מג / מל (באזירט אויף געמאסטן טרוקן וואָג), אָבער קיין דזשעלאַטיאָן איז באמערקט בעשאַס די 21 טאָג ינגקיוביישאַן ביי 37 ° C (סופּפּלעמענטאַרי פיגורע 2 אַ).
צו קוואַנטיפיצירן די דזשעלז, רהעאָלאָגיקאַל מעזשערמאַנץ קענען זיין געניצט צו לערנען די דזשעלאַטיאָן פּראָצעס און באַשטימען די קוילעלדיק מעטשאַניקאַל פּראָפּערטיעס.אין באַזונדער, מאָניטאָרינג די סטאָרידזש מאָדולוס (ילאַסטיסאַטי) ביי עלעוואַטעד טעמפּעראַטורעס קענען צושטעלן אינפֿאָרמאַציע וועגן די געלינג טעמפּעראַטור און וויסקאָעלאַסטיק פּראָפּערטיעס פון די קאָוטינג.טעמפּעראַטור העכערונג יקספּעראַמאַנץ (ניצן 1 ° C / מין ביי 25-45 ° C, באזירט אויף פרייַערדיק שטודיום ניצן נאַטירלעך זייַד לאַגער סאַלושאַנז) 40,41 געוויזן אַז די סטאָרידזש מאָדולע פון ​​His-NT2RepCT און NT סאַלושאַנז געוואקסן מיט ינקריסינג טעמפּעראַטור.איז געוואקסן (פיג. קסנומקס און סאַפּלאַמענטערי פייג. קסנומקס).נאָוטאַבלי, די NT מאָדולע סטאַרטעד גראָוינג ביי אַ נידעריקער טעמפּעראַטור קאַמפּערד מיט His-NT2RepCT, קאָנסיסטענט מיט די פאַסטער געל צייט באמערקט ווען NT איז גלייַך ינקובייטיד מיט His-NT2RepCT ביי 37 ° C (פיגורע 1).נאָך אַ סאַבסאַקוואַנט קאַפּ אין טעמפּעראַטור, די סטאָרידזש מאָדולוס האט נישט צוריקקומען צו נידעריקער וואַלועס און פארבליבן העכער די אָנווער מאָדולוס (זען סאַפּלאַמענערי פייג. 3), ינדאַקייטינג טערמאַל יריווערסאַבאַל סטאַביל דזשעלאַטיאָן.נאָך דזשעלאַטיאָן, די לעצט גומע מאָדולוס ריינדזשד פון 15 צו 330 kPa פֿאַר His-NT2RepCT כיידראָגעלס אין אַ קאַנסאַנטריישאַן פון 100-500 מג / מל, און די לעצט גומע מאָדולוס פֿאַר NT כיידראָגעלס (100-500 מג / מל) ריינדזשד פון 2 צו 1400. קפּאַ (Fig., 2 און גאַנץ ראַמפּע דאַטן) זען סאַפּלאַמענערי פייג. 3).
אַ ענדערונג אין טעמפּעראַטור בעשאַס מעזשערמאַנץ פון His-NT2RepCT (300 מג / מל) און b NT (300 מג / מל) מיט שאַקינג.די אַראָוז אָנווייַזן די טעמפּעראַטור גאַנג, און די לייטער שיידינג פון די סטאָרידזש מאָדולע דאַטן דיפּיקס טעסטינג מיט נידעריקער טאָרק וואַלועס פֿאַר די קיילע ווי ספּעסיפיעד דורך דער פאַבריקאַנט, וואָס איז די גרונט פון די געוואקסן ראַש.C סוף מאָדולע אַקיומיאַליישאַן פון His-NT2RepCT און NT נאָך עלעוואַטעד טעמפּעראַטור (100, 300 און 500 מג / מל).כל מאָדולע רידינגז זענען גענומען אין אַ אָפטקייַט פון 0.1 הז.
ווי אַ פּאָטענציעל אופֿן פֿאַר ינוועסטאַגייטינג קאַנפאָרמיישאַן ענדערונגען פֿאַרבונדן מיט דזשעלאַטיאָן, מיר רעקאָרדעד FTIR ספּעקטראַ פון His-NT2RepCT און NT איידער און נאָך דזשעלאַטיאָן ביי 37 ° C (פיגורע 3 אַ, ב).ווי דערוואַרט, די ספּעקטראַ פון His-NT2RepCT און NT סאַלושאַנז קאָראַספּאַנדיד צו פּראָטעינס וואָס ווייַזן אַ-העליקס / טראַפ - שפּול צווייטיק סטרוקטור, מיט אַ פּראַנאַונסט באַנד פון 1645 סענטימעטער-1.פֿאַר ביידע הידראָגעלס, דזשעלאַטיאָן ריזאַלטיד אין די פאָרמירונג פון צוויי געווער אין די מיטן איך באַנד אין וועגן 1617 סענטימעטער-1 און 1695 סענטימעטער-1 (פיגורע 3 אַ, ב), ינדאַקייטינג די פאָרמירונג פון אַנטיפּאַראַלעל β-בלאַט סטראַקטשערז.די ענדערונגען קענען אויך זיין קלאר געזען אין די ריספּעקטיוו צווייטער דעריוואַט און חילוק דזשעלאַטיאָן ספּעקטראַ (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 4 ב).די צוויי באַנדס פון די NT β-שיכטע זענען מער פּראַנאַונסט ווי די פון His-NT2RepCT, וואָס ינדיקייץ אַז די גאַנץ אינהאַלט פון β-שיכטע באַנדס אין די NT הידראָגעל איז העכער ווי די NT2RepCT הידראָגעל.
אַ FTIR אַבזאָרפּשאַן ספּעקטראַ פון His-NT2RepCT און b NT (ביידע 500 מג / מל) איידער (לייזונג) און נאָך (געל) ינגקיוביישאַן ביי 37 °C.C TEM בילדער פון רעסאַספּאַנדיד 50 מג / מל NT2RepCT דזשעלז און די NT.וואָג באַר 200 נם.E פיברע דיאַמעטערס פון His-NT2RepCT און NT הידראָגעלס.n = 100 געמאסטן פיברילז, פּ <0.0001.די טעות באַרס ווייַזן די נאָרמאַל דיווייישאַן.דער צענטער פון די טעות באַרס איז די דורכשניטלעך.אַ אַנפּערד ה-פּרובירן (צוויי-טיילד) איז געניצט פֿאַר סטאַטיסטיש אַנאַליסיס.טהט פלואָרעססענסע פון ​​פאַרשידן רעקאָמבינאַנט ספּידראָין פּראָטעינס (100 מג / מל) ביי 37 ° C אָן שאַקינג.ג נט (100 מג / מל) ינאַקיאַליישאַן יקספּעראַמאַנץ פון 100 מג / מל נט געל מיט 0%, 5%, 10% און 20% זאמען.
אַנאַליסיס פון די געל מיט טראַנסמיסיע עלעקטראָן מיקראָסקאָפּי (TEM) געוויזן אַז די הידראָגעל באשטייט פון אַמילאָיד-ווי פיבראַלז (פיגס. 3 ק, 3 ד).נט-געגרינדעט פיבראַלז זענען ילאָנגגייטאַד (5-12 נם אין דיאַמעטער) און אַנבראַנטשט, בשעת His-NT2RepCT פיברילז זענען קירצער אין לענג און באטייטיק ברייט אין דיאַמעטער (7-16 נם) (Fig. 3e).די רעזולטאַטן דערלויבט אונדז צו נאָכפאָלגן די קינעטיקס פון פיבראָסיס ניצן די טהיאָפלאַווין ט (טהט) אַסייַ.פֿאַר אַלע רעקאָמבינאַנט ספּידראָין פּראָטעינס, די פלורעסאַנט סיגנאַל געוואקסן ווען סאַמפּאַלז זענען ינקובייטיד בייַ 37 ° C (Fig. 3f, Supplementary Fig. 5a).קאָנסיסטענט מיט דעם דערגייונג, מיקראָסקאָפּיק דורכקוק פון NT און His-NT2RepCT אונטער געללינג טנאָים אנטפלעקט אַ מונדיר פאַרגרעסערן אין טהט פלואָרעססענסע אָן באמערקט היגע אַקיומיאַליישאַן פון טהט-positive אַגגרעגאַץ (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 5ב, C).די פאָרמירונג פון טהט-positive פיבראַלז איז נישט באגלייט דורך אַ פאַרגרעסערן אין NT און His-NTCT טורבידאַטי (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 5 ד), וואָס מיטל אַז אַ נעץ פון פיברילז אין די געל קען פאָרעם אָן קאַמפּראַמייזינג געל קלעריטי.סעדינג דורך אַדינג קליין אַמאַונץ פון פאַר-געגרינדעט פיברילז קענען באטייטיק פאַרגיכערן פיבריל פאָרמירונג פון עטלעכע אַמילאָידס42,43,44, אָבער אַדינג 5%, 10% אָדער 20% (וו / וו) NT צו אַ לייזונג פון NT כיידראָקאָאַגולאַנץ.סעדינג ווירקונג (פיג. קסנומקסג).טאָמער דאָס איז רעכט צו דעם פאַקט אַז די פיברילז אין די הידראָגעל זענען לעפיערעך פאַרפעסטיקט און קענען ניט זיין געוויינט ווי זאמען.
די אומגעריכט אָפּפירונג פון רעקאָמבינאַנט ספּידראָין פּראָטעינס ביי הויך טעמפּעראַטורעס פּראַמפּטיד ווייַטער יאָדער מאַגנעטיק אפקלאנג (NMR) ספּעקטראָסקאָפּי שטודיום צו ידענטיפיצירן קאַנפאָרמאַטיאָנאַל ענדערונגען פֿאַרבונדן מיט געל פאָרמירונג.NMR ספּעקטראַ פון His-NT2RepCT סאַלושאַנז רעקאָרדעד איבער צייַט ביי 37 ° C געוויזן אַז קאָרט איז נאָך טייל פאָולדיד, כוועראַז NT און 2Rep סיגנאַלז זענען פאַרשווונדן (Fig. 4a), סאַגדזשעסטינג אַז עס איז געווען דער הויפּט NT און 2Rep אַז טייל קאַנטראָולד פאָרמירונג פון His- NT2RepCT הידראָגעל.די קאָרט סיגנאַל איז אויך אַטטענואַטעד צו 20% פון זייַן אָריגינעל ינטענסיטי, סאַגדזשעסטינג אַז קאָרט איז אויך מערסטנס פאַרפעסטיקט און ינקאָרפּערייטיד אין די הידראָגעל סטרוקטור.פֿאַר אַ קלענערער חלק פון די קאָרט, וואָס איז ווי רירעוודיק ווי אין די פּרעינקיובייטיד מוסטער און אַזוי באמערקט דורך לייזונג NMR, די ספּעקטראַ פעלן סיגנאַלז פֿאַר די ערשטער 10 סטראַקטשערד רעזאַדוז, עפשער רעכט צו שווער ימאָובאַליזיישאַן פון די אַטאַטשט חלק פון His-NT2Rep.די NMR ספּעקטראַ פון די -שטאַט פון הידראָגעלס -NT2RepCT אנטפלעקט די פּרידאַמאַנאַנט בייַזייַן פון α-העליסע און β-לייַערס און, אין אַ ווייניקער מאָס, די טראַפ - שפּול קאַנפאָרמיישאַן (Fig. 4b).כעמישער יבעררוק אַנאַליסיס פון מעטהיאָנינע רעזאַדוז פאָרשטעלן בלויז אין NT געוויזן אַז דעם פעלד איז קאָנווערטעד צו אַ β-בלאַט סטרוקטור.די צייט-אָפענגיק ספּעקטראַ פון NT אין לייזונג געוויזן אַ מונדיר פאַרקלענערן אין סיגנאַל ינטענסיטי (Fig. 4c), און האַרט-שטאַט נמר פון NT הידראָגעלס געוויזן אַז רובֿ פון די NT רעזאַדוז זענען קאָנווערטעד צו β-בלאַט סטראַקטשערז (Fig. 4d).די קאַנפאָרמיישאַן פון 2Rep קען נישט זיין באשלאסן סעפּעראַטלי רעכט צו דער טענדענץ צו אַגגרעגירן.אָבער, די האַרט שטאַט NMR ספּעקטראַ פון די NTCT און His-NT2RepCT כיידראָגעלס געקוקט זייער ענלעך (Fig. 4b; Supplementary Fig. 6b), סאַגדזשעסטינג אַז 2Rep קאַנטריביוטיד ביסל צו די סטראַקטשעראַל טייל פון די His-NT2RepCT הידראָגעל.פֿאַר קאָרט הידראָגעלס, α-העליסע, β-שיץ, און טראַפ כעליקאַל צווייטיק סטראַקטשערז זענען געפונען צו עקסיסטירן (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 6 ד).דאָס סאַגדזשעסץ אַז עטלעכע טיילן פון די קאָרט בלייבן α-העליקס בשעת אנדערע ווערן β-שיץ.אזוי, די רעזולטאַטן פון NMR ספּעקטראַסקאָפּי פֿאָרשלאָגן אַז NT איז וויכטיק פֿאַר הידראָגעל פאָרמירונג און אויך טראַנספאָרמז אין אַ β-בלאַט קאַנפאָרמיישאַן נאָך פוסיאָן מיט 2Rep און CT.קאָנסיסטענט מיט דעם, מיר לעצטנס געפונען אַז אַמילאָיד ספּיישאַל זיפּערז מסתּמא פאָרעם אין אַלע פינף העליסעס פון די NT פעלד, און די וואַלץ אַלגערידאַם פּרעדיקטעד אַן אַמילאָידאָגעניק געגנט אין כיליקס 1 (Fig. 4e).
2 ד ספּעקטראַ פון 15N-HSQC 10 מג / מל His-NT2RepCT לייזונג איידער (בלוי) און 19 שעה נאָך ינגקיוביישאַן (רויט) ביי 37 ° C.יחיד קרייַז-פּיקס אין די רויט ספּעקטרום און F24, G136, פּאָליאַ אין די בלוי ספּעקטרום זענען דינאָוטיד דורך איין בריוו אַמינאָ זויער סימבאָלס און רעזאַדו נומערן.די ינסעץ ווייַזן די אָפענגיקייַט פון די סיגנאַל ינטענסיטי אין צייט פֿאַר אויסגעקליבן רעזאַדוז פון די NT, 2Rep און CT דאָומיינז.ב סאָליד-שטאַט ראַדיאָפרעקווענסי (RFDR) ספּעקטראַ פון His-NT2RepCT הידראָגעלס.קאָראַליישאַנז פון Cα / Cβ רעזאַדוז באמערקט אין RFDR ספּעקטראַ זענען באשלאסן דורך פאַרגלייַך מיט מאָדעל פּעפּטייד כעמישער שיפץ און וואַלועס דערייווד פון סטאַטיסטיק82,83 און זייער צווייטיק סטראַקטשערז.SSB - ראָוטייטינג סיידבאַנד.C איין-דימענשאַנאַל ספּעקטראַ פון 15N-HSQC 10 מג / מל נט לייזונג בעשאַס ינגקיוביישאַן ביי 37 °C פֿאַר 36 שעה.די ינסעט ווייזט וואָלומעטריק ינטענסיטי קעגן צייט.ד סאָליד שטאַט RFDR ספּעקטראַ פון NT הידראָגעלס.די קאָראַליישאַנז פון Cα / Cβ רעזאַדוז און זייער צווייטיק סטראַקטשערז באמערקט אין די RFDR ספּעקטראַ זענען אנגעוויזן.e באזירט אויף די NT45.79 פיבריליישאַן פּראַפּענסיטי פּראָפיל פֿון די זיפּפּער דאַטאַבייס (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).די ראָסעטאַ ענערגיע פון ​​די ספּיישאַל בליץ יבעררוק פֿענצטער פון די העקסאַפּעפּטידע איז געוויזן אין קייקאַל / מאָל.רויט באַרס זייַנען העקסאַפּעפּטידעס מיט אַ הויך פיבראָסיס פּראַפּענסיטי (ראָסעטטאַ ענערגיע אונטער -23 קייקאַל / מאָל; אונטער די דאַטיד שורה).גרין באַרס אָנווייַזן פראַגמאַנץ מיט ראָסעטטאַ ענערגיעס העכער די שוועל און דעריבער ווייניקער מסתּמא צו פאָרעם סטעריק זיפּערז.פראַגמאַנץ מיט פּראָלינע זענען יקסקלודיד פון די אַנאַליסיס (אָן שפאלטן).סקווערז אָנווייַזן געביטן פון אַמילאָידאָסיס פּרעדיקטעד דורך די וואַלץ אַלגערידאַם 81 (https://waltz.switchlab.org).די סיקוואַנס פון אַמינאָ זויער רעזאַדוז פון NT איז אין דער שפּיץ, און די טייפּס פון רעזאַדוז געפֿונען אין די β צווייטיק סטרוקטור (באשלאסן דורך האַרט-שטאַט NMR ספּעקטראָסקאָפּי) זענען געוויזן אין רויט.די שטעלעס פון די פינף NT α-העליסע זענען דעזיגנייטיד ווי (H1-H5)28.
ביי ף <6.5, HT דימערייזיז, זייַענדיק קעגנשטעליק צו היץ- אָדער ורעאַ-ינדוסט דינאַטוראַטיאָן18.צו דערקלערן ווי NT דימעריזאַטיאָן און פעסטקייַט ווירקן דזשעלאַטיאָן, סאַלושאַנז מיט 100 מג / מל NT זענען קאַנטראָולד ביי pH 8, 7 און 6 מיט די וויאַל ינווערזשאַן פּרובירן.NT סאַמפּאַלז ינקובייטיד ביי ף 8 און 7 געלד נאָך 30 מינוט בייַ 37 ° C, אָבער די ף 8 געל פארבליבן קלאָר, בשעת די ף 7 געל געוויזן אַ קענטיק אָפּזאַץ (Fig. 5 אַ).אין קאַנטראַסט, אַ לייזונג מיט הט ביי pH 6 האט נישט פאָרעם אַ געל, און אַ גרויס אָפּזאַץ קען זיין געזען נאָך 20 מינוט ביי 37 ° C.דאָס סאַגדזשעסץ אַז דימערס זיך און / אָדער זייער העכער פעסטקייַט קאַמפּערד מיט מאַנאַמערז פאַרמייַדן דזשעלאַטיאָן.די פאָרמירונג פון אַ אָפּזאַץ פֿאַר NT ביי ף 7 און 6 איז נישט דערוואַרט, ווייַל עס איז געווען געמאלדן אַז NT איז סאַליאַבאַל ביי 200 מג / מל 27, לייכט ריפאָלדז נאָך היץ דינאַטוריישאַן, און אויך ריטיינז אַ α-העליקס ביי נידעריקער וואַלועס פון ף 18. א פּראַבאַבאַל דערקלערונג פֿאַר די דיסקרעפּאַנסיז איז אַז די פריער געמאלדן יקספּעראַמאַנץ זענען דורכגעקאָכט אין צימער טעמפּעראַטור אָדער אונטן, אָדער אין לעפיערעך נידעריק פּראָטעין קאַנסאַנטריישאַנז16,18,19.
NT וויאַל ינווערזשאַן פּרובירן (100 מג / מל) ביי ף 8, 7, 6 און 154 מם נאַקל (פּה 8) נאָך ינגקיוביישאַן ביי 37 ° C.b NT CD ספּעקטראַ מיט און אָן 154 מם נאַף און 154 מם נאַקל, ריספּעקטיוולי.מאָלאַר יליפּטיקייט ביי 222 נם איז קאָנווערטעד צו אַ פּראָפּאָרציע פון ​​נאַטירלעך פאָולדז.C NT ינווערזשאַן אַסייַ (100 מג / מל) NT* (37 °C און 60 °C), NTA72R (37 °C), און His-NT-L6 (37 °C און 60 °C).ד סי ספּעקטראַ פון NT מיוטאַנץ NT *, NTA72R און His-NT-L6.מאָלאַר יליפּטיקייט ביי 222 נם איז קאָנווערטעד צו אַ פּראָפּאָרציע פון ​​נאַטירלעך פאָולדז.E ינווערזשאַן פּרובירן פון NTFlSp, NTMiSp און רידוסט NTMiSp (100 מג / מל).וואָג באַר 5 מם.f קאָמפּאַקטדיסק ספּעקטראַ פון NT, NTFlSp, NTMiSp און רידוסט NTMiSp.מאָלאַר יליפּטיקייט ביי 222 נם איז קאָנווערטעד צו אַ פּראָפּאָרציע פון ​​נאַטירלעך פאָולדז.גאַנץ NT ספּעקטראַ ביי 25 °C און 95 °C זענען געוויזן אין סאַפּלאַמענטערי פיגור 8.
פיזיאַלאַדזשיקאַל זאַלץ קאַנסאַנטריישאַן דיטערמאַנז ילעקטראָוסטאַטיק ינטעראַקשאַנז צווישן NT סובוניץ און דימעריזיישאַן פון NT אַריבערפירן צו נידעריקער pH18.מיר געפונען אַז די בייַזייַן פון 154 מם NaCl און NaF האט טאַקע ינכיבאַט דזשעלאַטיאָן ריספּעקטיוולי (Fig. 5a, B; Supplementary Fig. 2b) און אַז די סאָלץ געוואקסן די טערמאַל פעסטקייַט פון NT מאַנאַמערז (Fig. 5b, Supplementary Fig. 8) .עס אויך סאַגדזשעסץ אַז פעסטקייַט ענכאַנסמאַנט, אלא ווי דימעריזיישאַן, פּריווענץ געל פאָרמירונג.
צו ווייַטער ויספאָרשן די ראָלע פון ​​​​פּראָטעין דימעריזיישאַן און פעסטקייַט אין דזשעלאַטיאָן, מיר געוויינט צוויי מיוטאַנץ, NT * און NTA72R, וואָס אויך בלייבן מאָנאָמעריק ביי נידעריק pH28.30.NT * איז אַ טאָפּל אָפּצאָל מאַפּאָלע מוטאַנט אין וואָס די קלאָר דיפּאָלאַר אָפּצאָל פאַרשפּרייטונג פון די מאָנאָמער איז פלאַטאַנד, וואָס פּריווענץ דימעריזיישאַן און דראַסטיקלי ינקריסיז מאָנאָמער פעסטקייַט.NTA72R איז אַ באפוילן דיפּאָלע, אָבער Arg-substituted Ala איז ליגן בייַ די דימער גרענעץ, אַזוי מיוטיישאַנז אַרייַנמישנ זיך מיט סאַבוניט ינטעראַקשאַנז פארלאנגט פֿאַר דימעריזיישאַן.ביי ינגקיוביישאַן בייַ 37 ° C, NT * האט נישט פאָרעם אַ הידראָגעל, בשעת NTA72R געשאפן אַן אָופּייק געל פֿאַר 15 מינוט (Fig. 5c).זינט ביידע NT * און NTA72R קענען נישט דימערייז אָבער אַנדערש אין מאָנאָמער פעסטקייַט (פיגורע 5 ד), די רעזולטאַטן שטארק פֿאָרשלאָגן אַז הויך טהערמאָדינאַמיק פעסטקייַט פּריווענץ NT פון געללינג.דאָס איז אויך געשטיצט דורך די פאַקט אַז הט * פארמען אַ געל ווען עס איז אַנסטייבאַל בייַ הויך טעמפּעראַטור (נאָך 8 מינוט בייַ 60 ° C; Fig. 5c).עס איז פריער געוויזן אַז די הויך אינהאַלט פון מעטהיאָנינע אין NT ליקוואַפייז זייַן נאַטירלעך פאָלדינג און אַז זעקס מעט צו לעו סאַבסטאַטוץ (רעפערד צו דאָ ווי His-NT-L6) שטארק סטייבאַלייז די NT46 מאָנאָמער.באַזירט אויף די האַשאָרע אַז סטראַקטשעראַל בייגיקייַט איז פארלאנגט פֿאַר NT געל פאָרמירונג, מיר געפֿונען אַז די His-NT-L6 סטאַביל מוטאַנט איז נישט געל ביי 37 ° C (פיגורע 5c, ד).אָבער, His-NT-L6 אויך געשאפן אַ געל אויף ינגקיוביישאַן בייַ 60 ° C פֿאַר 60 מין (Fig. 5c).
די פיייקייט פון NT צו יבערמאַכן אין β-בלאַט סטראַקטשערז און פאָרעם כיידראָדזשאַלז אַפּלייז צו עטלעכע אָבער ניט אַלע די NT דאָומיינז פון ספּידראָין.נץ פון פאַרשידענע זייַד טייפּס און שפּין מינים, Trichonephila clavipes (NTFlSp), געשאפן דזשעלז טראָץ זייער לעפיערעך נידעריק מעטהיאָנינע אינהאַלט און הויך טערמאַל פעסטקייַט (Fig. 5e, F און Supplementary Table 2).אין קאַנטראַסט, NT פון די קליין אַמפּולאַר פּראָטעין ספּידראָין פון Araneus ventricosus (NTMiSp) מיט נידעריק טערמאַל פעסטקייַט און הויך מעטהיאָנינע צופרידן האט נישט פאָרעם הידראָגעלס (סופּפּלעמענטאַרי טאַבלע 2 און Fig. 5e, F).די יענער קען זיין פארבונדן מיט דעם בייַזייַן פון ינטראַמאָלעקולאַר דיסולפידע קייטן29,47.קאַנסיסטאַנטלי, ווען די דיסולפידע קייטן פון NTMiSp זענען רידוסט, עס געשאפן אַ הידראָגעל נאָך ינגקיוביישאַן ביי 37 ° C פֿאַר 10 מינוט (Fig. 5e).אין מסקנא, עס זאָל זיין אנגעוויזן אַז סטראַקטשעראַל בייגיקייַט איז אַ וויכטיק, אָבער ניט דער בלויז, קריטעריאָן פֿאַר די פאָרמירונג פון אַ געל פון NT.אן אנדער פאַקטאָר וואָס קען זיין באַטייַטיק איז די פּראַפּענסיטי צו פאָרעם אַמילאָיד פיברילז, און אַנאַליסיס מיט די זיפּפּער דאַטאַבייס און די וואַלץ אַלגערידאַם האט געוויזן אַ קאָראַליישאַן צווישן די פיייקייט צו פאָרעם דזשעלז און די בייַזייַן פון אַמילאָידאָגעניק מקומות, ווי געזונט ווי די מאָס פון די פּרעדיקטעד מקומות. צו פאָרעם סטעריק זיפּערז.עס איז געווען אַ קאָראַליישאַן (סופּפּלעמענטאַרי טאַבלע 2 און סאַפּלאַמענטערי פייג. 9).
די פיייקייט פון NT צו פאָרעם פיברילז און פאָרעם דזשעלז אונטער גינציק טנאָים געפירט אונדז צו כייפּאַטאַסייזד אַז NT פיוזשאַנז מיט אנדערע פּראָטעין פראַגמאַנץ קענען נאָך פאָרעם דזשעלז מיט פול פונקציע פון ​​​​פוסיאָן פּאַרטנערס.צו פּרובירן דאָס, מיר באַקענענ גרין פלורעסאַנט פּראָטעין (GFP) און פּורינע נוקלעאָסידע פאָספאָרילאַסע (PNP) ריספּעקטיוולי ביי די C-טערמינוס פון די NT.די ריזאַלטינג פוסיאָן פּראָטעינס זענען אויסגעדריקט אין E. קאָלי מיט זייער הויך לעצט ייעלדס (150 מג / ל און 256 מג / ל טרייסלען קאָלבע קאַלטשערז פֿאַר His-NT-GFP און His-NT-PNP, ריספּעקטיוולי), קאָנסיסטענט מיט וואָס איז געוויזן. פֿאַר אנדערע פּראָטעינס פיוזד צו NT Ref.30. His-NT-GFP (300mg/mL) און His-NT-PNP (100mg/mL) פיוזשאַן פּראָטעינס געשאפן דזשעלז נאָך 2 שעה און 6.5 שעה ביי 37 ° C און, ימפּאָרטאַנטלי, די GFP בראָכצאָל פארבליבן אַנטשיינדזשד.באמערקט נאָך דזשעלאַטיאָן, מיט> 70% פון די ערשט פלורעסאַנס ינטענסיטי רוען נאָך דזשעלאַטיאָן (Fig. 6 אַ).צו מעסטן PNP טעטיקייט אין זיין-NT-PNP סאַלושאַנז און דזשעלז, מיר האָבן צו צעפירן די פוסיאָן פּראָטעין מיט NT ווייַל די ענזימאַטיק טעטיקייט פון די ריין צוגרייטונג איז געווען אַרויס די דיטעקשאַן קייט פון די אַסיי ביי געללינג קאַנסאַנטריישאַנז.די געל געשאפן מיט אַ געמיש מיט 0.01 מג / מל היס-נט-פּנפּ און 100 מג / מל נט ריטיינד 65% פון די ערשט ענזימאַטיק טעטיקייט פון די פּרעינקיובייטיד סאַמפּאַלז (Fig. 6ב).די געל פארבליבן בעשאָלעם בעשאַס די מעזשערמאַנט (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 10).
אַ קאָרעוו פלואָרעססענסע ינטענסיטי איידער און נאָך דזשעלאַטיאָן פון His-NT-GFP (300 מג / מל) און ינווערטיד וויאַל מיט His-NT-GFP הידראָגעל (300 מג / מל) אונטער קענטיק און ווו ליכט.ווייזט ווייַזן יחיד מעזשערמאַנץ (n = 3), טעות באַרס ווייַזן נאָרמאַל דיווייישאַן.די דורכשניטלעך ווערט איז געוויזן אין די צענטער פון די טעות באַרס.ב פּנפּ טעטיקייט איז באקומען דורך פלואָראָמעטריק אַנאַליסיס ניצן סאַלושאַנז און דזשעלז קאַנסיסטינג פון נט (100 מג / מל) און אַ געמיש מיט 0.01 מג / מל זיין-נט-פּנפּ און 100 מג / מל ניו טייוואַן דאָללאַרס.די ינסעט ווייַזן אַ ינווערטיד וויאַל מיט אַ הידראָגעל מיט His-NT-PNP (5 מם וואָג באַר).
דאָ, מיר באַריכט די פאָרמירונג פון הידראָגעלס פון NT און אנדערע רעקאָמבינאַנט ספּידראָין פּראָטעינס דורך ינגקיובייטינג אַ פּראָטעין לייזונג ביי 37 ° C (פיגורע 1).מיר ווייַזן אַז דזשעלאַטיאָן איז פֿאַרבונדן מיט די טראַנספאָרמאַציע פון ​​α-העליסע אין β-שיכטן און די פאָרמירונג פון אַמילאָיד-ווי פיבראַלז (פיגס. 3 און 4).דער דערגייונג איז חידוש ווייַל NTs זענען קוילד גלאָובולאַר פינף-העליקס באַנדאַלז באַוווסט פֿאַר זייער גאָר הויך סאָלוביליטי און הויך פעסטקייַט אין קאַנסאַנטריישאַנז> 200 מג / מל ביי 4 ° C פֿאַר עטלעכע טעג27.אין אַדישאַן, NTs לייכט ריפאָלד נאָך היץ דינאַטוריישאַן ביי נידעריק פּראָטעין קאַנסאַנטריישאַנז אין μM.לויט אונדזער רעזולטאַטן, פיבריל פאָרמירונג ריקווייערז אַ קאָמבינאַציע פון> 10 מג / מל פּראָטעין קאַנסאַנטריישאַן און אַ ביסל עלעוואַטעד טעמפּעראַטור (Fig. 1).דאָס איז קאָנסיסטענט מיט דער געדאַנק אַז אַמילאָיד פיברילז קענען פאָרעם פון גלאָבולאַרלי פאָולדיד פּראָטעינס וואָס זענען אין אַ טייל אַנפאָולדאַד שטאַט רעכט צו טערמאַל פלאַקטשויישאַנז אונטער פיזיאַלאַדזשיקאַל טנאָים 48 .ביישפילן פון פּראָטעינס וואָס אַנדערגאָו דעם קאַנווערזשאַן אַרייַננעמען ינסאַלאַן49,50, β2-מיקראָגלאָבולין, טראַנסטהירעטין און ליסאָזימע51,52,53.כאָטש NT איז אַ α-העליקס אין זייַן געבוירן שטאַט, בעערעך 65% פון די פּאָליפּעפּטידע קייט איז קאַמפּאַטאַבאַל מיט סטעריק בליצ - שלעסל פאָרמירונג (Fig. 4e) 45.זינט די מאָנאָמער איז דינאַמיקאַללי רירעוודיק46, עס קענען ויסשטעלן די פּאָטענציעל אַמילאָידאָגעניק מקומות ביי מאַדעראַטלי עלעוואַטעד טעמפּעראַטורעס און אין הויך קאַנסאַנטריישאַנז פון גאַנץ פּראָטעין קענען דערגרייכן אַ קריטיש קאַנסאַנטריישאַן פֿאַר אַמילאָיד פיבריל פאָרמירונג.נאָך דעם ריזאַנינג, מיר געפֿונען אַ נעגאַטיוו קאָראַליישאַן צווישן ספּידראָין קאַנסאַנטריישאַן און דזשעלאַטיאָן צייט (Fig. 1c), און אויב די מאָנאָמעריק NT קאַנפאָרמיישאַן איז סטייבאַלייזד אָדער דורך מיוטיישאַנז (NT*, His-NT-L6) אָדער דורך זאַלץ אַדישאַן, קענען פאַרמייַדן פאָרמירונג הידראָגעלס (פיגורע 5).
אין רובֿ קאַסעס, אַמילאָיד פיברילז פאַרשווינדן פון לייזונג ווי אַ אָפּזאַץ, אָבער אונטער זיכער טנאָים זיי קענען פאָרעם הידראָגעלס55,56,57.הידראָגעל-פאָרמינג פיבראַלז טיפּיקלי האָבן אַ הויך אַספּעקט פאַרהעלטעניש און פאָרעם סטאַביל דריי-דימענשאַנאַל נעטוואָרקס דורך מאָלעקולאַר ענטאַנגגאַלמאַנט, 55,58 קאָנסיסטענט מיט אונדזער רעזולטאַטן.פֿאַר הידראָגעל פאָרמירונג אין וויטראָ, פּראָטעינס זענען אָפט גאָר אָדער טייל אַנפאָולדאַד, פֿאַר בייַשפּיל, דורך ויסשטעלן צו אָרגאַניק סאָלוואַנץ, הויך טעמפּעראַטור (70-90 ° C) און / אָדער נידעריק ף (1.5-3.0) 59,60,61,62.די ספּידראָין הידראָגעלס דיסקרייבד דאָ טאָן ניט דאַרפן האַרב פּראַסעסינג, און טאָן ניט דאַרפן קרייַז-לינקינג אגענטן צו סטייבאַלייז די הידראָגעלס.
עס איז פריער געמאלדן אַז ספּידראָין ריפּיץ און QDs, וואָס דערשייַנען צו אַנדערגאָו β-בלאַט סוויטשינג בעשאַס זייַד ספּיננינג, פאָרעם הידראָגעלס.קאַמפּערד מיט אונדזער פיינדינגז, ינגקיוביישאַן צייט און / אָדער ינגקיוביישאַן טעמפּעראַטורעס זענען ריספּעקטיוולי ריספּעקטיוולי מער אָדער העכער, און די ריזאַלטינג הידראָגעלס זענען אָפט אָופּייק (פיגורע 7 און סאַפּלאַמענערי טאַבלע 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. אין אַדישאַן צו שנעל געל מאל, NT הידראָגעלס> 300 מג / מל (30%) אַוטפּערפאָרמד אַלע אנדערע דיסקרייבד רעקאָמבינאַנט שפּין זייַד פּראָטעין כיידראָדזשאַלז, ווי געזונט ווי נאַטירלעך כיידראָדזשאַלז אַזאַ ווי דזשעלאַטאַן, אַלדזשינאַט (2%), אַגאַר (0.5% ) און קאַלאַגאַן.(0.6%) (פיגורע 7 און סאַפּלאַמענטערי טאַבלעס 1 און 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
די געל צייט און די גומע מאָדולוס פון די הידראָגעלס אין דעם לערנען זענען קאַמפּערד מיט אנדערע ספּידראָין-באזירט הידראָגעלס און אויסגעקליבן נאַטירלעך כיידראָדזשאַלז.רעפערענצן זענען געגעבן צוזאמען מיט אַ באַשרייַבונג פון די דזשעלאַטיאָן טנאָים.אַפּפּס אַמאָוניאַם פּערסאַלפייט, צימער טעמפּעראַטור.דאַטן 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
ספּיידערז דערשייַנען צו האָבן דעוועלאָפּעד וועגן צו פאַרמייַדן ספּידראָין פון געללינג בעשאַס סטאָרידזש.טראָץ די הויך קאַנסאַנטריישאַן פון פּראָטעין אין די זייַד דריז, די גרויס איבערחזרן געגנט פֿאַרבונדן מיט די וואָקזאַל פעלד מיטל אַז די קלאָר קאַנסאַנטריישאַן פון NT און CT אין די דריז קאָראַספּאַנדז צו בעערעך 10-20 מג / מל, בייַ די גרענעץ פון דעם לערנען.פארלאנגט פֿאַר ינ וויטראָ באמערקט הידראָגעל פאָרמירונג.אין דערצו, ענלעך קאַנסאַנטריישאַנז פון סאָלץ 16 סטייבאַלייזד נט, ווי אין זייַד גלאַנדז (פיג. 5 ב).NT קאַנפאָרמיישאַן איז געלערנט אין די E. קאָלי סיטאָסאָל און געפונען צו זיין מער טייטלי פאָולדיד ווי ווען יגזאַמאַנד אין וויטראָ, ווייַטער ינדאַקייטינג אַז זאַלץ אָדער אנדערע סיבות פאַרמייַדן זייַן אַגגרעגאַטיאָן אין וויוואָו.אָבער, די פיייקייט פון NTs צו יבערמאַכן אין β-בלאַט פיבראַלז קען זיין וויכטיק פֿאַר פאָדעם פאָרמירונג און זאָל זיין ינוועסטאַגייטאַד אין צוקונפֿט שטודיום.
אין אַדישאַן צו די ראָמאַן אַספּעקץ פון נט-אַמילאָיד-ווי פיבריל און הידראָגעל פאָרמירונג באמערקט אין דעם לערנען, מיר אויך ווייַזן אַז דעם דערשיינונג קען האָבן ביאָטעטשנאָלאָגיקאַל און ביאָמעדיקאַל אַפּלאַקיישאַנז (Fig. 8).ווי אַ דערווייַז פון באַגריף, מיר קאַמביינד NT מיט GFP אָדער PNP און געוויזן אַז די פוסיאָן פּראָטעין אויך פארמען הידראָגעלס ווען ינגקיובייטיד ביי 37 ° C און אַז די GFP און PNP פראַקשאַנז לאַרגעלי ריטיין זייער טעטיקייט נאָך דזשעלאַטיאָן (פיגורע 6).נוקלעאָסידע פאָספאָרילאַסעס זענען וויכטיק קאַטאַליסץ סינטעז פון נוקלעאָסידע אַנאַלאָגועס75, וואָס מאכט אונדזער ופדעקונג באַטייַטיק פֿאַר די ביאָפאַרמאַסוטיקאַל אינדוסטריע.דער באַגריף פון יקספּרעסינג פוסיאָן פּראָטעינס וואָס פאָרעם טראַנספּעראַנט הידראָגעלס אונטער גינציק טנאָים אַלאַוז די שאַפונג פון פאַנגקשאַנאַלייזד הידראָגעלס מיט גינציק פּראָפּערטיעס פֿאַר אַ ברייט קייט פון אַפּלאַקיישאַנז אַזאַ ווי ענזיים ימאָובאַלאַזיישאַן, קאַנטראָולד מעדיצין מעלדונג און געוועב ינזשעניעריע.אין אַדישאַן, NT און NT * זענען עפעקטיוו אויסדרוק מאַרקערס 30, וואָס מיטל אַז NT און זייַן וועריאַנץ קענען זיין געוויינט פֿאַר הויך-דורכקייט פּראָדוקציע פון ​​סאַליאַבאַל פוסיאָן פּראָטעינס און סאַבסאַקוואַנט שאַפונג פון ימאָובאַלייזד ציל פּראָטעינס אין 3 ד הידראָגעלס.
NT איז סאַליאַבאַל, α-העליקאַל און סטאַביל אין נידעריק קאַנסאַנטריישאַנז (μM) און 37 °C.אין דער זעלביקער טעמפּעראַטור, אָבער אין ינקריסינג קאַנסאַנטריישאַנז (>10 מג / מל), NT פארמען דזשעלז קאַנסיסטינג פון אַמילאָיד-ווי פיבראַלז.NT פוסיאָן פּראָטעינס אויך פאָרעם פיבריללאַר דזשעלז מיט גאָר פאַנגקשאַנאַל פוסיאָן פראַגמאַנץ, אַלאַוינג פאַרשידן פּראָטעינס צו זיין ימאָובאַלייזד אין 3 ד הידראָגעלס ניצן NT.דנאָ: NT (PDB: 4FBS) און אילוסטראציעס פון פיברע נעטוואָרקס און פֿאַרבונדן פּראָטעין סטראַקטשערז (גענומען און ניט ציען צו וואָג, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4J).
די קאַנסטראַקשאַנז (זען סאַפּלאַמענערי טאַבלע 4 פֿאַר אַ פולשטענדיק רשימה אַרייַנגערעכנט אַמינאָ זויער סיקוואַנסיז) זענען קלאָונד אין פּלאַזמיד פּט7 און פארוואנדלען אין E. קאָלי BL21 (DE3).י קאָלי מיט ענדזשאַנירד פּלאַסמיידז זענען ינאַקיאַלייטיד אין לוריאַ יויך סאַפּלאַמענטאַד מיט קאַנאַמיסין (70 מג / ל) און דערוואַקסן יבערנאַכטיק ביי 30 ° C און 250 רפּם.די קולטור איז דעמאָלט ינאַקיאַלייטיד 1/100 אין לב מיטל מיט קאַנאַמיסין און קאַלטשערד ביי 30 ° C און 110 רפּם ביז די OD600 ריטשט 0.8.פֿאַר NMR שטודיום, באַקטיריאַ זענען דערוואַקסן אין M9 מינימאַל מיטל מיט 2 ג פון ד-גלוקאָוס 13C (Aldrich) און 1 ג פון אַמאָוניאַם קלאָרייד 15N (Cambridge Isotope Laboratories, ינק.) פֿאַר פּראָטעין לייבלינג מיט יסאָטאָפּעס.נידעריקער דער טעמפּעראַטור צו 20 דיגריז סעלסיוס און פאַרשאַפן פּראָטעין אויסדרוק מיט 0.15 מם יסאָפּראָפּילטהיאָגאַלאַקטאָפּיראַנאָסידע (לעצט קאַנסאַנטריישאַן).נאָך יבערנאַכטיק פּראָטעין אויסדרוק, סעלז זענען כאַרוואַסטיד ביי 7278 × ג, 4 ° C פֿאַר 20 מינוט.צעל פּעלאַץ זענען ריסאַספּאַנדיד אין 20 מם טריס-הקל, pH 8, און פאַרפרוירן ביז ווייַטער נוצן.טאָד סעלז זענען ליסעד ניצן אַ צעל דיסראַפּטער (TS סעריע מאשינען, Constant Systems Limited, ענגלאַנד) ביי 30 קפּאַ.דערנאָך די ליסאַטעס זענען סענטריפוגעד ביי 25,000 ג פֿאַר 30 מינוט בייַ 4 ° C.פֿאַר NTMiSp, די שרייטל איז דעמאָלט ריסאַספּאַנדיד אין 2 ם ורעאַ, 20 מם טריס-הקל, ף 8, און סאָניקאַטעד פֿאַר 2 מינוט (2 s אויף / אַוועק, 65%), דעמאָלט סענטריפודזשד ווידער ביי 25,000 קסג, 4 ° C. 30 מין.די סופּערנאַטאַנט איז לאָודיד אַנטו אַ ני-נטאַ זייַל, געוואשן מיט 20 מם טריס-הקל, 2 מם ימידאַזאָל, ף 8, און לעסאָף די פּראָטעין איז געווען ילוטאַד מיט 20 מם טריס-הקל, 200 מם ימידאַזאָל, ף 8. צו דזשענערייט נט2רעפּקט און NTCT, טהראָמבין דיידזשעסטשאַן ינטראַדוסיז די פּלאַץ (ThrCleav) צווישן His און NT.טהראָמבין קלעאַוואַגע זייטלעך זענען אויך פאָרשטעלן אין His-NT-ThrCleav-2Rep (פּראַדוסיז 2Rep), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT (פּראַדוסיז NT), His-Thioredoxin-ThrCleav-CT (פּראַדוסיז CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (פּראַדוסיז NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (פּראַדוסיז NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (פּראַדוסיז NTF1Sp), און His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (פּראַדוסיז NTMiSp).די קאַנסטראַקשאַנז זענען דיידזשעסטיד מיט טהראָמבין (1: 1000) און דייאַליסיזעד יבערנאַכטיק ביי 4 ° סי מיט 20 מם טריס-הקל, ף 8, ניצן אַ ספּעקטראַ / פּאָר דיאַליסיס מעמבראַנע מיט אַ מאָלעקולאַר וואָג שוועל פון 6-8 kDa.נאָך דייאַליסיס, די לייזונג איז לאָודיד אַנטו אַ Ni-NTA זייַל און די עפלוענט מיט די פּראָטעין פון אינטערעס איז געזאמלט.פּראָטעין קאַנסאַנטריישאַנז זענען באשלאסן דורך מעסטן UV אַבזאָרבאַנס ביי 280 נם ניצן די יקסטינגשאַן קאָואַפישאַנט פון יעדער פּראָטעין, אַחוץ פֿאַר NTF1Sp, וואָס געוויינט די בראַדפאָרד אַסייַי לויט די פּראָטאָקאָל פון דער פאַבריקאַנט.ריינקייַט איז באשלאסן דורך SDS פּאָליאַקרילאַמידע (4-20%) געל עלעקטראָפאָרעסיס און קאָאָמאַססיע בריליאַנט בלוי סטיינינג.פּראָטעינס זענען קאַנסאַנטרייטאַד מיט סענטריפודזש פילטערס (VivaSpin 20, GE Healthcare) ביי 4000 קג מיט אַ 10 kDa מאָלעקולאַר וואָג קאַטאָף אין 20 מינוט סייקאַלז.
טאָ די פּראָטעין לייזונג און קערפאַלי פּיפּעטן 150 μל אין אַ 1 מל קלאָר סעפּטום וויאַל (8 X 40 מם טערמאָ ססיענטיפיק).די טובז זענען קאַפּט און געחתמעט מיט פּאַראַפילם צו פאַרמייַדן יוואַפּעריישאַן.סאַמפּאַלז (n = 3) זענען ינקובייטיד בייַ 37 ° C אָדער 60 ° C און פּיריאַדיקלי ינווערטיד צו אָבסערווירן דזשעלאַטיאָן.סאַמפּאַלז וואָס האָבן נישט געל זענען ינקובייטיד פֿאַר בייַ מינדסטער איין וואָך.רעדוצירן דיסולפידע קייטן פון NTMiSp מיט 10 מם DTT פּער 10 μM פּראָטעין.צו פונאַנדערקלייַבן די דזשעלאַטיאָן פון נאַטירלעך שפּין זייַד קאָוטינגז, די שוועדיש בריק שפּין איז שנייַדן, די צוויי הויפּט אַמפּולאַטעד גלאַנדז זענען געשטעלט אין 200 μל פון 20 מם טריס-הקל באַפער pH 8 און שנייַדן צו לאָזן די קאָוטינג צו באַזונדער פון די גלאַנדז..די אינהאַלט פון די גלאַנדז איז צעלאָזן אין באַפער, 50 μל פֿאַר באַשטימונג פון טרוקן וואָג (דורך ינגקיוביישאַן פון עפענען ווייאַלז ביי 60 ° C צו קעסיידערדיק וואָג) און 150 μל פֿאַר דזשעלאַטיאָן ביי 37 ° C.
די מעסטן דזשיאַמאַטרי / געצייַג איז געמאכט פון ומבאַפלעקט שטאָל מיט אַ פּאַראַלעל טעלער מיט אַ שפּיץ דיאַמעטער פון 20 מם און אַ ריס פון 0.5 מם.היץ די מוסטער פון 25 °C צו 45 °C און צוריק צו 25 °C מיט אַ קורס פון 1 °C פּער מינוט ניצן אַ ומבאַפלעקט שטאָל דנאָ פּעלטיער טעלער.ווייבריישאַן מעזשערמאַנץ זענען דורכגעקאָכט מיט אַ אָפטקייַט פון 0.1 הז און אין די לינעאַר וויסקאָעלאַסטיק געגנט פון דעם מאַטעריאַל מיט אַ שפּאַנונג פון 5% און 0.5% פֿאַר סאַמפּאַלז פון 100 מג / מל און 300-500 מג / מל, ריספּעקטיוולי.ניצן אַ מנהג הומידיטי קאַמער צו פאַרמייַדן יוואַפּעריישאַן.די דאַטן זענען אַנאַלייזד מיט Prism 9.
פֿאַר קאַלעקטינג ינפרערעד (יר) ספּעקטראַ אין צימער טעמפּעראַטור פון 800 צו 3900 סענטימעטער-1.די ATR מיטל, ווי געזונט ווי די ליכט דרך דורך די ספּעקטראָמעטער, איז פּורגעד מיט טרוקן פילטערד לופט איידער און בעשאַס דעם עקספּערימענט.סאַלושאַנז (500 מג / מל צו מינאַמייז וואַסער אַבזאָרפּשאַן פּיקס אין די ספּעקטראַ) זענען פּיפּעטטעד אַנטו די קריסטאַלז, און דזשעלז (500 מג / מל) זענען געשאפן איידער מעזשערמאַנט און דעמאָלט טראַנספערד צו די קריסטאַלז (n = 3).1000 סקאַנז זענען רעקאָרדעד מיט אַ האַכלאָטע פון ​​2 סענטימעטער-1 און נול פליכט ציקל פון 2. די רגע דעריוואַט איז קאַלקיאַלייטיד ניצן OPUS (ברוקער) ניצן אַ סמודינג קייט פון נייַן פונקטן.די ספּעקטראַ זענען נאָרמאַלייזד צו דער זעלביקער ינטאַגריישאַן געגנט צווישן 1720 און 1580 סענטימעטער-1 ניצן F. Menges "ספּעקטראַגריף - אָפּטיש ספּעקטראָסקאָפּי ווייכווארג".אין ATR-IR ספּעקטראָסקאָפּי, די דורכדרונג טיפקייַט פון אַ ינפרערעד שטראַל אין אַ מוסטער איז אָפענגיק אויף ווייוונומבערס, וואָס ריזאַלטינג אין שטארקער אַבזאָרפּשאַן ביי נידעריקער ווייוונומבערס ווי אין העכער ווייוונומבערס.די יפעקץ זענען נישט קערעקטאַד פֿאַר די ספּעקטראַ געוויזן אין פיגס.3 ווייַל זיי זענען זייער קליין (סאַפּלאַמענערי פייג. 4).קערעקטאַד ספּעקטראַ פֿאַר דעם פיגור זענען קאַלקיאַלייטיד מיט די Bruker OPUS ווייכווארג.
אין פּרינציפּ, אַ פולשטענדיק קוואַנטאַפאַקיישאַן פון פּראָטעין קאַנפאָרמיישאַנז איז מעגלעך נאָך פאַרלאָזלעך דיקאַנוואַלושאַן פון די קאַמפּאָונאַנץ ין דער אַמיד איך שפּיץ.אָבער, עטלעכע מניעות אויפשטיין אין פיר.ראַש אין די ספּעקטרום קענען דערשייַנען ווי (פאַלש) פּיקס בעשאַס דיקאַנוואַלושאַן.אין אַדישאַן, דער שפּיץ רעכט צו וואַסער בענדינג קאָוינסיידז מיט די שטעלע פון ​​די שפּיץ פון אַמידע איך און קען האָבן אַ ענלעך גרייס פֿאַר סאַמפּאַלז מיט אַ גרויס סומע פון ​​וואַסער, אַזאַ ווי די ייקוויאַס געל געלערנט דאָ.דעריבער, מיר האָבן נישט פּרווון צו גאָר צעלייגנ די אַמידע איך שפּיץ, און אונדזער אַבזערוויישאַנז זאָל זיין באַטראַכט בלויז אין שטיצן פון אנדערע מעטהאָדס אַזאַ ווי NMR ספּעקטראַסקאָפּי.
סאַלושאַנז פון 50 מג / מל NT און His-NT2RepCT זענען געלד יבערנאַכטיק ביי 37 ° C.די הידראָגעל איז דעמאָלט דיילוטאַד מיט 20 מם טריס-הקל (pH 8) צו אַ קאַנסאַנטריישאַן פון 12.5 מג / מל, שאַקינג געזונט און פּיפּעטטיד צו ברעכן די געל.דערנאָך, די הידראָגעל איז דיילוטאַד 10 מאל מיט 20 מם טריס-הקל (pH 8), 5 μל פון די מוסטער איז געווען געווענדט צו אַ קופּער גריד קאָוטאַד מיט פאָרמוואַר, און די וידעפדיק מוסטער איז אַוועקגענומען מיט בלאָטינג פּאַפּיר.סאַמפּאַלז זענען געוואשן צוויי מאָל מיט 5 μל פון MilliQ וואַסער און סטיינד מיט 1% וראַניל פאָרמאַטאַטע פֿאַר 5 מינוט.אַראָפּנעמען וידעפדיק פלעק מיט אַבזאָרבאַנט פּאַפּיר, דעמאָלט לופט טרוקן די ייגל.ימאַגינג איז דורכגעקאָכט אויף די גרידס מיט אַ FEI Teknai 12 Spirit BioTWIN אַפּערייטינג ביי 100 קוו.די בילדער זענען רעקאָרדעד אין X 26,500 און X 43,000 מאַגנאַפאַקיישאַנז מיט אַ Veleta 2k × 2k CCD אַפּאַראַט (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, דייַטשלאַנד).פֿאַר יעדער מוסטער (n = 1), 10-15 בילדער זענען רעקאָרדעד.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) איז געניצט פֿאַר בילד אַנאַליסיס און מעזשערמאַנט פון פיברע דיאַמעטערס (n = 100, פאַרשידענע פייבערז).פּריזמע 9 איז געניצט צו דורכפירן אַנפּערד ה-טעסטס (צוויי-טיילד).די דורכשניטלעך His-NT2RepCT און NT פיברילז זענען ריספּעקטיוולי 11.43 (סד 2.035) און 7.67 (סד 1.389) נם.די בטחון ינטערוואַל (95%) איז -4.246 צו -3.275.פרייהייט גראַד = 198, פּ <0.0001.
80 μל פליסיק סאַמפּאַלז מיט 10 μM טהיאָפלאַווין ט (טהט) זענען געמאסטן אין טריפּליקאַט (n = 3) אונטער סטאַטיק טנאָים ניצן קאָרנינג 96-געזונט שוואַרץ דנאָ קלאָר דנאָ פּלאַטעס (Corning Glass 3881, USA).פלואָרעססענסע דיפעראַנסיז זענען רעקאָרדעד מיט אַ 440 nm עקסייטיישאַן פילטער און אַ 480 nm ימישאַן פילטער (FLUOStar Galaxy פון BMG Labtech, Offenburg, דייַטשלאַנד).די טהט סיגנאַל איז ניט סאַטשערייטאַד אדער קווענטשעד, ווייַל יקספּעראַמאַנץ מיט פאַרשידענע קאַנסאַנטריישאַנז פון טהט זענען דורכגעקאָכט אָן טשאַנגינג די סיגנאַל ינטענסיטי.רעקאָרדירן אַבזאָרפּשאַן ביי 360 נם פֿאַר האַזע מעזשערמאַנט.פֿאַר סעדינג יקספּעראַמאַנץ, 100 מג / מל דזשעלז זענען געשאפן ביי 37 ° סי, ריסאַספּאַנדיד און געניצט פֿאַר סעדינג אין מאָלאַר ריישיאָוז פון 5%, 10% און 20%.די דאַטן זענען אַנאַלייזד מיט Prism 9.
טאָ סטאַקס פון His-NT2RepCT און NT>100 מג / מל אויף אייז און פילטער דורך אַ 0.22 μm פילטער.קאַנסאַנטריישאַנז זענען קאַלקיאַלייטיד דורך מעסטן אַבזאָרבאַנס ביי 280 נם ניצן נאַנאָדראָפּ.אין וועלז פון אַ 96-געזונט שוואַרץ ניט-ביינדינג טעלער (קאָרנינג) מיט אַ קלאָר דנאָ, סאַמפּאַלז זענען דיילוטאַד צו 20 מג / מל אין 20 מם Tris-Hcl pH 8 און געמישט מיט 5 μM ThT (ענדלעך קאַנסאַנטריישאַן), גאַנץ מוסטער קאַנסאַנטריישאַן. 50 μל באַנד.סאַמפּאַלז זענען ימאַדזשד יעדער 10 מינוט ביי 37 ° C אויף אַ CellObserver (Zeiss) מיקראָסקאָפּ מיט טראַנסמיטטעד ליכט קאַנאַל און FITC עקסייטיישאַן און ימישאַן פילטער שטעלט פֿאַר טהט ימידזשינג.א 20x/0.4 אָביעקטיוו איז געניצט פֿאַר ימידזשינג.Zen Blue (Zeiss) און ImageJ (https://imagej.nih.gov/) זענען געניצט פֿאַר בילד אַנאַליסיס.דזשעלז זענען אויך צוגעגרייט פון NT און His-NT2RepCT סאַלושאַנז אין אַ קאַנסאַנטריישאַן פון 50 מג / מל מיט 20 מם טריס pH 8 און 5 μM טהט און ינקובייטיד ביי 37 ° C פֿאַר 90 מינוט.די געל ברעקלעך זענען טראַנספערד צו אַ נייַ געזונט מיט 20 מם טריס, pH 8 און 5 μM טהט אין אַ ניט-ביינדינג שוואַרץ 96 געזונט קלאָר דנאָ טעלער.קריגן גרין פלורעסאַנס און העל פעלד בילדער אין 20x/0.4 מאַגנאַפאַקיישאַן.ImageJ איז געניצט פֿאַר בילד אַנאַליסיס.
לייזונג נמר ספּעקטראַ זענען באקומען ביי 310 ק אויף אַ 600 מהז Bruker Avance נעאָ ספּעקטראָמעטער יקוויפּט מיט אַ QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).נמר סאַמפּאַלז מיט 10 מג / מל כאָומאַדזשיניאַס פּראָטעין מיטן נאָמען 13C, 15N, צעלאָזן אין 20 מם טריס-הקל (pH 8), 0.02% (וו / וו) NaN3, 5% DO (v / v), (n = 1) .כעמישער שיפץ פון NT2RepCT ביי pH 6.7 זענען געניצט צו באַשטימען שפּיץ 23 אין די 2D ספּעקטרום פון 15N-HSQC.
מאַגיק ווינקל ספּיננינג האַרט NMR (MAS) ספּעקטראַ פון 13C, 15N-לייבאַלד כיידראָדזשאַלז זענען רעקאָרדעד אויף אַ Bruker Avance III HD ספּעקטראָומעטער ביי 800 מהז יקוויפּט מיט אַ 3.2 מם 13C/15N {1H} עלעקטראָניש זאָנד.מוסטער טעמפּעראַטור איז קאַנטראָולד ניצן אַ בייַטעוודיק טעמפּעראַטור גאַז טייַך בייַ 277 ק. צוויי-דימענשאַנאַל דיפּאָלע ראָוטיישאַנאַל אפקלאנג (DARR) 76 און ראַדיאָ אָפטקייַט ריקאַנעקשאַן (RFDR) 77 ספּעקטראַ זענען קונה ביי MAS פריקוואַנסיז פון 12.5 כז און 20 כז, ריספּעקטיוולי.קרייַז פּאָולעראַזיישאַן (קפּ) פון 1H צו 13C איז דורכגעקאָכט מיט אַ לינעאַר ראַמפּע פון ​​60.0 צו 48.0 כז ביי 1H, 61.3/71.6 כז ביי 13C (ביי 12.5/20 כז MAS) און קאָנטאַקט צייט 0.5-1 מיז.ספּינאַל 6478 דיקאָופּלינג ביי 73.5 כז איז געניצט בעשאַס דאַטן זאַמלונג.די אַקוואַזישאַן צייט איז געווען 10 מיליסעקאַנדז און די ציקל פאַרהאַלטן איז געווען 2.5 סעקונדעס.די איין-לינגקט Cα / Cβ קאָראַליישאַנז באמערקט אין די RFDR ספּעקטראַ זענען אַסיינד באזירט אויף די כאַראַקטעריסטיש רעזאַדו-טיפּ כעמישער שיפץ און מערן-לינגקט קאָראַליישאַנז אין די DARR ספּעקטראַ.
די Zipper79 דאַטאַבייס (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) איז געניצט צו אָפּשאַצן פלאַטער טענדאַנסיז און ראָסעטטאַ ענערגיע פֿאַר NT, NTFlSp און NTMiSp.די זיפּפּער דאַטאַבייס קאַמפּיוץ Rosetta Energy80, וואָס קאַמביינז עטלעכע פריי ענערגיע פאַנגקשאַנז צו מאָדעל און אַנאַלייז פּראָטעין סטרוקטור.אַן ענערגיע מדרגה פון -23 קייקאַל / מאָל אָדער נידעריקער ינדיקייץ אַ הויך טענדענץ צו פיבריללייט.דער נידעריקער ענערגיע מיטל מער פעסטקייַט פון די צוויי β-סטראַנדז אין די זיפּפּער קאַנפאָרמיישאַן.אין אַדישאַן, די וואַלץ אַלגערידאַם איז געניצט צו פאָרויסזאָגן אַמילאָידאָגעניק מקומות אין NT, NTFlSp און NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
די NT פּראָטעין לייזונג איז געווען געמישט מיט 2-(N-מאָרפאָלינאָ) עטהאַנעסולפאָניק זויער (מעס) באַפער ביי pH 5.5 און 6.0 צו נידעריקער די ף צו pH 6 און 7, ריספּעקטיוולי.די לעצט פּראָטעין קאַנסאַנטריישאַן איז געווען 100 מג / מל.
מעזשערמאַנץ זענען דורכגעקאָכט אויף אַ J-1500 קאָמפּאַקטדיסק ספּעקטראָמעטער (JASCO, USA) ניצן אַ 300 μ ל קווועט מיט אַ אָפּטיש דרך פון 0.1 סענטימעטער.פּראָטעינס זענען דיילוטאַד צו 10 μם (n = 1) אין 20 מם פאַספייט באַפער (pH 8).צו פונאַנדערקלייַבן פּראָטעין פעסטקייַט אין דעם בייַזייַן פון זאַלץ, פּראָטעינס זענען אַנאַלייזד אין דער זעלביקער קאַנסאַנטריישאַן (n = 1) אין 20 מם פאַספייט באַפער (pH 8) מיט 154 מם NaF אָדער NaCl, ריספּעקטיוולי.טעמפּעראַטור סקאַנז זענען רעקאָרדעד ביי 222 נם פון 25 ° C צו 95 ° C מיט אַ באַהיצונג קורס פון 1 ° C / מין.די פּראָפּאָרציע פון ​​נאַטיווע פאָולדיד פּראָטעינס איז קאַלקיאַלייטיד מיט די פאָרמולע (KDmeasure - KDfinal) / (KDstart - KDfinal).אין דערצו, פינף ספּעקטראַ זענען רעקאָרדעד פֿאַר יעדער מוסטער פון 260 נם צו 190 נם ביי 25 ° C און נאָך באַהיצונג צו 95 ° C.פינף ספּעקטראַ זענען אַוורידזשד, סמודד און קאָנווערטעד צו מאָלאַר יליפּטאַסיטי.די דאַטן זענען אַנאַלייזד מיט Prism 9.
די פלואָרעססענסע ינטענסיטי פון His-NT-GFP (300 מג / מל, 80 μL) איז געמאסטן אין טריפּליקאַט (n = 3) אין 96-געזונט קאָרנינג פּלאַטעס מיט אַ שוואַרץ טראַנספּעראַנט דנאָ (Corning Glass 3881, USA) אונטער סטאַטיק טנאָים.מעסטן סאַמפּאַלז מיט אַ פלורעסאַנס-באזירט טעלער לייענער מיט אַן עקסייטיישאַן ווייוולענגט פון 395 נם און רעקאָרדירן די ימישאַן ביי 509 נם איידער דזשעלאַטיאָן און 2 שעה שפּעטער ביי 37 ° C.די דאַטן זענען אַנאַלייזד מיט Prism 9.
פּורינע נוקלעאָסידע פאָספאָרילאַסע אַקטיוויטעט אַסיינמאַנט קיט (פלואָראָמעטריק אופֿן, Sigma Aldrich) איז געניצט לויט דער פאַבריקאַנט ס ינסטראַקשאַנז.צו מעסטן טעטיקייט אין דזשעלז און סאַלושאַנז מיט His-NT-PNP, מישן 10 ng פון His-NT-PNP מיט 100 מג / מל NT צו אַ גאַנץ באַנד פון 2 μL ווייַל די געל האט אַ סיגנאַל העכער די דיטעקשאַן מעהאַלעך פון די שטעלן.קאָנטראָלס פֿאַר דזשעלז און סאַלושאַנז אָן His-NT-PNP זענען אַרייַנגערעכנט.די מעזשערמאַנץ זענען געפירט אויס צוויי מאָל (n = 2).נאָך די טעטיקייט איז געמאסטן, די אָפּרוף געמיש איז אַוועקגענומען און די געל פאָוטאַגראַפט צו ענשור אַז די געל פארבליבן בעשאָלעם בעשאַס די מעזשערמאַנט.די דאַטן זענען אַנאַלייזד מיט Prism 9.
פֿאַר מער אינפֿאָרמאַציע וועגן לערנען פּלאַן, זען די נאַטור לערנען אַבסטראַקט לינגקט צו דעם אַרטיקל.
פיגיערז 1 און 2 פאָרשטעלן די ערשט דאַטן.1 ק, 2 אַ-ק, 3 אַ, ב, ע-ג, 4, 5 ב, ד, עף, און 6, סאַפּלאַמענערי פייגן.3, סאַפּלאַמענטערי פייַג.5 אַ, ד, סאַפּלאַמענטערי פייַג.6 און סאַפּלאַמענטערי פייַג.8. דאַטאַ דאַטאַ פון דעם לערנען איז כאָוסטיד אין די זענאָדאָ דאַטאַבייס https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.די NMR דאַטן באקומען אין דעם לערנען זענען פּאָסטעד צו די BMRBig ריפּאַזאַטאָרי אונטער די פּאָזיציע ID bmrbig36.די סטראַקטשערז פון GFP און PNP זענען גענומען פֿון PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
רייזינג, יי און דזשאָהאַנססאָן, י ספּיננינג קינסטלעך שפּין זייַד.נאַשאַנאַל כעמישער.ביאָלאָגי.11, 309-315 (2015).
באַבב, PL עט על.די נעפילאַ קלאַוויפּעס גענאָמע כיילייץ די דייווערסיטי פון שפּין זייַד גענעס און זייער קאָמפּלעקס אויסדרוק.נאַציאָנאַלער גענעט.49, 895-903 (2017).